Ein Multi-Kompartiment-ZNS-Neuron-Glia-Co-Kultur mikrofluidischen Plattform

Summary

Wir entwickelten eine neuartige Multi-Kompartiment-Neuron Co-Kultur Mikrosystem-Plattform für in-vitro-ZNS-Axon-Glia-Interaktionen Forschung. Die Plattform ist in der Lage die Durchführung von bis zu sechs unabhängigen Experimenten parallel und wurde unter Verwendung eines neu entwickelten Makro / micro hybrid Herstellungsverfahren.

Abstract

Wir präsentieren ein neuartiges Multi-Kompartiment-Neuron Co-Kultur Mikrosystem-Plattform für in-vitro-ZNS-Axon-Glia-Interaktionen Forschung, leiten kann bis zu sechs unabhängigen Experimenten parallel zur höheren Durchsatz. Wir entwickelten ein neues Herstellungsverfahren für Mikrofluidik-Geräte, die sowohl Mikro-und Makroebene Strukturen innerhalb des gleichen Geräts über einen einzigen Soft-Lithographie-Prozess zu schaffen, damit Massenfertigung mit guter Reproduzierbarkeit.

Die Multi-Kompartiment-mikrofluidischen Co-Kultur-Plattform besteht aus einem Soma Fach für Neuronen und sechs Axon / Glia Fächer für Oligodendrozyten (OLS) zusammen. Die Soma-Fach und Axon / Glia Kammern sind durch Anordnungen von angeschlossenen Axon-Führung Mikrokanäle, die als physische Barrieren zu neuronalen Soma in Soma Fach beschränken, während gleichzeitig Axone in Axon / Glia Fächer wachsen. OLs in Axon / Glia Fächer geladen werden können nur interagieren mit Axonen, aber nicht mit neuronalen Soma oder Dendriten, so dass lokalisierte Axon-Glia-Interaktion Studien. Die Mikrokanäle ebenfalls aktiviert fluidische Trennung zwischen Fächern, so dass sechs unabhängige Experimente auf einem einzigen Gerät für höheren Durchsatz durchgeführt werden.

Soft-Lithographie mit Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) ist eine häufig verwendete Technik in der biomedizinischen Bauelemente. Reservoirs auf diesen Geräten werden üblicherweise durch manuelles Stanzen definiert. Obwohl einfach, schlechte Ausrichtung und zeitaufwendig Natur des Prozesses macht diesen Prozess nicht geeignet, wenn eine große Anzahl von Stauseen immer wieder geschaffen werden müssen. Die neu entwickelte Methode nicht erforderlich manuelles Stanzen von Stauseen, die Überwindung dieser Beschränkungen. Erste, sieben Stauseen (Tiefe: 3,5 mm) wurden auf einem Poly (Methylmethacrylat) (PMMA)-Block mit einem Mikro-Fräsmaschine hergestellt. Dann wurden Arrays von Grat Mikrostrukturen auf einem Glassubstrat hergestellt, heißgeprägtem gegen den PMMA-Block, um Mikrokanäle, dass die Soma und Axon / Glia Fächer verbinden zu definieren. Dieser Prozess führte in Makro-Reservoirs (3,5 mm) und Mikro-Maßstab Kanäle (2,5 um) innerhalb eines einzigen PMMA Master übereinstimmen. Ein PDMS Replikat, das als eine Form Meister serviert wurde unter Verwendung von Soft-Lithographie und die endgültige PDMS Gerät wurde von diesem Master repliziert.

Primäre Neuronen aus E16-18 Ratten wurden auf die Soma-Fach geladen und kultiviert für zwei Wochen. Nach einer Woche der Zellkultur, überquerte Axone Mikrokanäle und bildete axonalen nur Netzwerk-Layer innerhalb Axon / Glia Fächern. Axone wuchsen gleichmäßig über sechs Axon / Glia Fächer und OLS aus P1-2 Ratten wurden Axon / Glia Fächern an 14 Tagen in vitro für Co-Kultur hinzugefügt.

Protocol

Teil 1: Vorbereiten eines Master-Form für mehrere Brandabschnitte Neuron Co-Kultur Bauelementherstellung

1. Erster Schritt zum PMMA Master herzustellen ist bis 3,5 mm tief Fächer zu machen. Ein soma Fach und sechs Axon / Glia Fächer sind auf einem PMMA-Block mit einem Mikro-Fräsmaschine (MDX-40, Roland oder andere CNC-Fräsmaschine) definiert. PMMA-Master ist dann in Isopropylalkohol für 10 Minuten, um Ablagerungen zu entfernen beschallt.
2. Arrays von 2,5 um Höhenrücken Strukturen sind auf einem 50,8 mm x 50,8 mm Glasplatte mit einem Standard-Photolithographie-Prozess, durch Nassätzen des Glases folgt strukturiert.
   Zunächst werden Reihe von Bergrücken Strukturen auf einem gereinigten Glassubstrat mit Positivphotoresist S1818 mit Photolithographie. S1818 ist auf dem Substrat (4000 rpm), weiche Basis bei 110 Spin-Coating ° C für 5 min und dann mit UV-Licht (84 mJ / cm ²⁾ mit einem Mask Aligner durch die Entwicklung der Photoresist in MF319 für 40, gefolgt Sekunden. Als nächstes wird der Fotolack gemusterten Glassubstrat in gepufferten Oxidätzung (BOE) bei Raumtemperatur für 6-7 Minuten eingetaucht, um einen 2,5 um groß Grat Strukturen zu erhalten. Schließlich ist der Photoresistschicht durch Aceton und Isopropylalkohol entfernt, gefolgt von gründlichem Spülen in deionisiertem Wasser (DI).
3. Glassubstrat mit Mikro-Grat Strukturen heißgeprägtem gegen die PMMA Meister seine Muster zu übertragen.
   Erstens sind PMMA Form beherrschen und Glassubstraten manuell ausgerichtet und auf eine hot-drücken. Dann ist die Temperatur auf 115 ° C erhöht Sobald die gewünschte Temperatur erreicht ist, 0,5 Tonnen Gewicht für 5 Minuten angewendet wird. Nach 5 Minuten ist die Temperatur auf 40 ° C und einem Druck freigegeben wird gekühlt. Die PMMA-Master ist dann in ein 50,8 mm x 50,8 mm Größe Block geschnitten.
4. 1 Gew.: PDMS pre-Polymer (Sylgard 184) ist mit Härter im Verhältnis von 10 gemischt.
5. PMMA-Master befindet sich in einem Fass und PDMS-Mischung ist auf der Oberseite des PMMA Meister gegossen, um ein PDMS Master herzustellen platziert. Es ist dann in einem Exsikkator an eine Vakuum-Pumpe. PDMS gegossen oben auf PMMA-Master ist dann für 15 Minuten entgast, um Luftblasen während des PDMS Mischvorgang erzeugt entfernen.
6. Wenn alle Luftblasen entfernt sind, ist PDMS in einem eingeebnet 85 ° C Ofen für eine Stunde zur Polymerisation gebracht.
7. Sobald PDMS vollständig ausgehärtet ist, wird PDMS Meister aus dem PMMA Master geschält und in einen Exsikkator mit 2-3 Tropfen von Trichlorsilan und abgesaugt werden für 15 Minuten in Dampf Mantel der PDMS-Master Oberfläche. Trichlorsilan-Beschichtung erleichtert die Veröffentlichung der finalen PDMS Neuron Co-Kultur-Geräte aus der PDMS-Master. Nach der Beschichtung wird die PDMS-Master kurz mit Isopropylalkohol gespült, um übermäßige Trichlorsilan zu entfernen, und trocknet sie mit N _2-Gas.

Teil 2: Neuron Kultur Gerät Replikation

1. 1 Gew.: PDMS pre-Polymer (Sylgard 184) ist mit Härter im Verhältnis von 10 gemischt.
2. PDMS-Mischung ist auf der Oberseite des PDMS Meister gegossen und entgast in einem Exsikkator an eine Vakuum-Pumpe für 15 Minuten. Es ist wichtig, nicht zu viel PDMS so pour dass die 3,5 mm hohen PDMS-Struktur auf dem Master nicht vollständig eingetaucht.
3. Wenn alle Luftblasen entfernt sind, ist PDMS in einem eingeebnet 85 ° C Ofen für eine Stunde zur Polymerisation gebracht.
4. PDMS wird aus dem Ofen nach einer Stunde entnommen und bei Raumtemperatur stehen gelassen, um abzukühlen. Dann werden PDMS Neuron Kultur-Geräte vorsichtig aus dem PDMS Master abgelöst. Abgeschält PDMS-Geräte sind mit Parafilm umwickelt, um sie vor Staub oder Schmutz zu schützen.
5. PDMS-Geräte, mit Parafilm umwickelt, sind in einzelne Stücke mit einer Bohrmaschine mit einem Messer ausgerüstet geschnitten.

Teil 3: Device Montage

1. PDMS Neuron Kultur Gerät ist im Plasma Reiniger gelegt und die Luft-Plasma für 90 Sekunden, um die Oberfläche des PDMS Gerät hydrophil. Dieser Plasma-Behandlung erleichtert Mikrokanäle mit Kulturmedien nach der Montage zu Poly-D-Lysin beschichteten Substrat gefüllt werden.
2. Geräte mit Plasma behandelt werden anschließend in 70% Ethanol für 30 Minuten für die Sterilisation eingetaucht und bewegt im Inneren des sterilisiert bio-Haube.
3. Sterilisiert Geräte sind aus 70% Ethanol aufgenommen und trocknet sie mit Millipore gefiltert N _2-Gas. Getrocknete Geräte sind auf der Oberseite des Poly-D-Lysin beschichteten Polystyrol gelegt 6-well-Kulturplatte und sanften Druck ausgeübt wird, um die Dichtung zwischen dem Substrat und das Gerät zu gewährleisten.
4. Kulturmedien wird dann in den Soma-Fach gefüllt, gefolgt durch das Ausfüllen der sechs Axon / Glia Fächern. Es ist besser zu geben 1-2 Minuten Pause vor dem Befüllen Axon / Glia Fächer nach der Zugabe von Nährmedien in die Soma-Fach, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen in den Mikrokanälen gefangen sind.
5. Geräte mit Nährmedien gefüllt ist innerhalb eines 37 ° C Inkubator über Nacht um eventuelle Fremdkörper oder giftige Rückstände abspülen inkubiert.

Teil 4: Cell Be-und Neuronen-Oligodendrozyten-Co-Kultur

1. Am ersten Tag der Zellkultur, primäre Vorderhirn Nervenzellen aus Embryonaltag 16-18 Ratten werden in der Soma Fach an einer Flächendichte von 500 Zellen / mm ² geladen. Erstens sind Kulturmedien innen sowohl das Soma-Fach und Axon / Glia Fächern abgesaugt mit Pipette vor Zelle geladen. Dann werden 38.500 Zellen in 40 ul von Kulturmedien verdünnt, um die Soma-Fach auf der ganzen Mikrokanal Buchten geladen. Es ist wichtig, nicht auf die PDMS-Gerät berühren, während das Laden der Zellen, da es die Dichtung zwischen dem Gerät und dem Substrat kann brechen.
2. Inkubieren Sie die Zellen geladen werden Geräte für 30 Minuten innerhalb eines 37 ° C Inkubator für Zell-Adhäsion auf dem Substrat zu verbessern. Nach der Inkubation werden alle Fächer mit Nährmedien gefüllt.
3. Die Zellen werden bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO _2-Inkubator und nur die Hälfte von Nährmedien erfolgt alle 3-4 Tage gewechselt.
4. Nach 14 Tagen des Neurons Kultur in vitro, sind Oligodendrozyten, die Axone / Glia Fächer für Co-Kultur hinzugefügt. Oligodendrozyten, aus der zerebralen Hemisphären des Sprague-Dawley Ratten bei postnatalen Tag 1-2 seziert werden, um jedes Axon / Glia Fach auf einer Fläche Dichte von 1000 Zellen / mm ² aufgenommen. Vor dem Laden Zellen sind etwa 60% der Kulturmedien in den Fächern mit Pipette angesaugt wird. Vorsicht muss nicht auf den Boden berühren Substrat sein, da es die axonale Netzwerk auf dem Substrat gebildet beschädigen können. Dann werden 6700 Oligodendrozyten Zellen, in 5 ul von Kulturmedien verdünnt, um das Axon / Glia Fächer aufgenommen. Die Zellen werden für 1 Stunde inkubiert und Fächer sind mit Nährmedien gefüllt.
5. Die Zellen werden bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO _2-Inkubator und nur die Hälfte von Nährmedien erfolgt alle 3-4 Tage für zwei weitere Wochen geändert.

Teil 5: Repräsentative Ergebnisse:

Wenn Experimente ordnungsgemäß durchgeführt werden, Nervenzellen geladen, um die Soma-Fach zu schließen, um Mikrokanal Buchten und axonalen Schicht lokalisieren beginnen im Inneren des Axons / Glia Fächer bilden nach 1 Woche der Kultur. Sign of Neuronzelle Aggregation in der Soma-Fach kann ein Indiz dafür, dass Zellen nicht gesund sein. Beim Laden von Oligodendrozyten nach zwei Wochen Neuron Kultur, Axon / Glia Fächer sollten mit dichten Schicht von Axonen und Oligodendrozyten bedeckt sein sollte auf der Oberseite des axonalen Schicht geladen werden.

Abbildung 1. Schematische Darstellungen der High-Throughput-Mikrofluidik Multi-Kompartiment-ZNS-Neuron Co-Kultur-Plattform. Cross-Querschnittsansicht Isolation der Axone von Nervenzellen Soma und Dendriten sowie fluidische Trennung zwischen Abteilen mit winzigen fluidische Höhenunterschied. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.

Abbildung 2. Fertigungs-und Montageschritte für die Multi-Kompartiment-PDMS mikrofluidischen Co-Kultur-Gerät. Jedes Gerät passt in eine Vertiefung einer konventionellen 6-well Polystyrol Zellkulturplatte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen.

Discussion

Wir haben eine multi-Fach Co-Kultur-Plattform für das Studium Säuger-ZNS Axon-Glia-Interaktionen entwickelt. ZNS Axone wurden erfolgreich von neuronalen Zellkörpern / Dendriten isoliert und Oligodendrozyten wurden erfolgreich im Inneren des Gerätes co-kultiviert. Neuron Dichte kann von Anwendungen verändert werden, sondern zu niedrige oder zu hohe Konzentration kann dazu führen, Zellen zu sterben. Auch ist es wichtig, nur die Hälfte von Nährmedien, so dass die Zellen oder axonalen Schicht auf dem Substrat nicht beschädigt zu ändern. Wir erwarten, dass dieses System ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium CNS Axon-Glia Signalnetzwerke in vitro und geben Sie einen Pfad zu einem High-Throughput-Screening-Plattform für Wachstumsfaktoren oder potenziellen Wirkstoffkandidaten, die Myelinisierung und Myelin-Reparatur zu fördern.