Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mitochondria के खमीर कक्ष से शोधन

Published: August 24, 2009 doi: 10.3791/1417
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Concordia University

Summary

हम खमीर से mitochondria की शुद्धि के लिए एक तेजी से और प्रभावी विधि का वर्णन

Abstract

यूकेरियोटिक गैर संश्लेषक कोशिकाओं में एरोबिक चयापचय के दौरान Mitochondria एटीपी उत्पादन का मुख्य साइट

Protocol

सामग्री और विधियों

खमीर उपभेदों और विकास की स्थिति

जंगली प्रकार तनाव BY4742 (leu2Δ0 MATα his3Δ1 lys2Δ0 ura3Δ0) अमीर YEPD माध्यम में हो गया था (1% खमीर निकालने, 2% peptone, 2% ग्लूकोज). कक्ष में 30 ° Erlenmeyer बोतल में 200 rpm पर "फ्लास्क मात्रा / मात्रा मध्यम" 5:01 के अनुपात में घूर्णी झटकों के साथ सी सुसंस्कृत थे.

कच्चे mitochondrial अंश के अलगाव

  1. 48 एच. के लिए जंगली प्रकार तनाव BY4742 संस्कृति का 1 एल आगे बढ़ें
  2. 500 मिलीलीटर Nalgene अपकेंद्रित्र ट्यूबों में संस्कृति डालो. लोड और कमरे के तापमान पर 3000 XG पर 5 मिनट के लिए फसल कोशिकाओं centrifugation द्वारा बैलेंस.
  3. DH2O के 250 मिलीलीटर में छानना सतह पर तैरनेवाला और resuspend pelleted कोशिकाओं. गोली कोशिकाओं centrifugation द्वारा कमरे के तापमान पर 3000 XG पर 5 मिनट के लिए.
  4. DH2O के 250 मिलीलीटर में छानना सतह पर तैरनेवाला और resuspend pelleted कोशिकाओं. गोली कोशिकाओं centrifugation द्वारा कमरे के तापमान पर 3000 XG पर 5 मिनट के लिए.
  5. गीला सेल गोली के वजन का निर्धारण करते हैं.
  6. डीटीटी बफर [बफर / छ कोशिकाओं (गीला वजन) के 2 मिलीग्राम] में pelleted कोशिकाओं Resuspend.
  7. 50 मिलीलीटर फाल्कन प्लास्टिक ट्यूबों के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण.
  8. एक प्रकार के बरतन में 70 rpm पर 30 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ट्यूबों घुमाएँ
  9. Centrifugation द्वारा कमरे के तापमान पर 3000 XG पर 5 मिनट के लिए हार्वेस्ट कोशिकाओं.
  10. Zymolyase [बफर / छ कोशिकाओं (गीला वजन) के 7 मिलीग्राम] बिना Zymolyase बफर में pelleted कोशिकाओं Resuspend.
  11. गोली कोशिकाओं centrifugation द्वारा कमरे के तापमान पर 3000 XG पर 5 मिनट के लिए.
  12. Zymolyase [बफर / छ कोशिकाओं (गीला वजन) के 7 मिलीग्राम] बिना Zymolyase बफर में pelleted कोशिकाओं Resuspend.
  13. एक गिलास फ्लास्क सेल निलंबन स्थानांतरण.
  14. Zymolyase-100T का पाउडर जोड़ें [1 मिलीग्राम / Zymolyase-100T जी कोशिकाओं (गीला वजन) के] सेल निलंबन के लिए.
  15. सेल निलंबन के साथ एक प्रकार के बरतन में 70 rpm पर 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए फ्लास्क घुमाएँ
  16. स्थानांतरण spheroplasts Zymolyase-100T से 50 मिलीलीटर प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूबों के साथ सेल की दीवार के पाचन के कारण का गठन किया था.
  17. Centrifugation द्वारा 2200 XG में 8 मिनट के लिए 4 में spheroplasts ° सी. गोली

** सभी बाद के चरणों 4 में डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर बाहर किया जाना चाहिए. Spheroplasts के निलंबन धीरे कटौती सुझावों के साथ pipettes का उपयोग organelles तोड़ने से बचने संभाला होना चाहिए .**

  1. ठंडा homogenization बफर [बफर / छ कोशिकाओं (गीला वजन) के 6.5 मिलीग्राम] में pelleted spheroplasts Resuspend.
  2. Centrifugation द्वारा 2200 XG में 8 मिनट के लिए 4 में spheroplasts ° सी. गोली
  3. ठंडा homogenization बफर [बफर / छ कोशिकाओं (गीला वजन) के 6.5 मिलीग्राम] में pelleted spheroplasts Resuspend.
  4. बर्फ गिलास homogenizer पर एक पूर्व ठंडा कोशिकाओं स्थानांतरण.
  5. एक तंग मूसल का प्रयोग, मूसल के 15 स्ट्रोक बनाने द्वारा कोशिकाओं homogenize.
  6. 1 ठंडा homogenization बफर मात्रा जोड़ें.
  7. 50 मिलीलीटर प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूबों homogenized spheroplasts स्थानांतरण.
  8. 1500 XG पर 5 मिनट के लिए 4 में centrifuging से अटूट कोशिकाओं, नाभिक, और बड़े मलबे गोली डिग्री सेल्सियस
  9. 4 में 3000 XG पर 5 मिनट के लिए जिसके परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
  10. 4 डिग्री सेल्सियस के XG 12000 पर 15 मिनट के लिए जिसके परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र
  11. छानना सतह पर तैरनेवाला और बर्फ ठंड homogenization बफर में resuspend गोली [बफर / छ कोशिकाओं (गीला वजन) के 6.5 मिलीग्राम]
  12. 4 में 3000 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
  13. 4 डिग्री सेल्सियस के XG 12000 पर 15 मिनट के लिए जिसके परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र
  14. छानना सतह पर तैरनेवाला और ठंडा SEM बफर के 3 मिलीलीटर में resuspend गोली.

** हालांकि इस निलंबन mitochondria में समृद्ध है, यह भी अन्य organelles जैसे endoplasmic जालिका (microsomes), Golgi, और vacuoles हैं. शुद्ध mitochondria करने के लिए, इस कच्चे mitochondrial अंश आगे fractionation अधीन किया जा सकता है, जैसा कि नीचे वर्णित .**

अन्य organelles द्वारा mitochondria के संदूषण से रहित की शुद्धि

  1. एक Beckman अल्ट्रा साफ अपकेंद्रित्र ट्यूब में जगह ठंडा 60% की 1.5 मिलीलीटर (w / v) EM बफर में sucrose.
  2. ओवरले 60 (w / v)% 32% 4 मिलीलीटर के साथ sucrose, 23% की 1.5 मिलीलीटर, 15% sucrose (सभी v / EM में wt बफर) के 1.5 मिलीलीटर.
  3. 15 (w / v)% sucrose के शीर्ष पर कच्चे SEM बफर में mitochondrial अंश के 3 मिलीलीटर रखें.
  4. Beckman 1 4 134000 XG (३३००० ​​आरपीएम) में ज डिग्री सेल्सियस के लिए SW41 तिवारी रोटर झूल बाल्टी में अपकेंद्रित्र
  5. बरकरार mitochondria के रूप में 60% / 32% sucrose के अंतरफलक पर एक भूरे रंग के बैंड.
  6. ध्यान से mitochondrial बैंड तक पहुँचने तक sucrose हटा दें.
  7. एक कट टिप के साथ mitochondrial बैंड का उपयोग कर एक विंदुक निकालें और एक Beckman अपकेंद्रित्र ट्यूब में यह एक MLS 5 रोटर के लिए जगह है.
  8. ट्यूब SEM बफर के साथ भरें.
  9. 4 में शुद्ध mitochondria के 30 मिनट के लिए एक MLS 10,000 XG (+३१००० rpm) पर 30 मिनट के लिए 5 रोटर में centrifugation द्वारा गोली डिग्री सेल्सियस
  10. छानना का उपयोग सतह पर तैरनेवालाएक विंदुक.
  11. Mitochondrial कार्यों, mitochondrial proteome और lipidome, और mitochondrial डीएनए के विश्लेषण के लिए शुद्ध mitochondria का उपयोग करें.

अभिकर्मकों

  1. डीटीटी [100 Tris/H2SO4 मिमी (9.4 पीएच), 10 मिमी dithiothreitol] (15 मिलीलीटर के लिए बफर)
    • 1 एम Tris/H2SO4 बफर के 1.5 मिलीलीटर (9.4 पीएच)
    • 1 एम डीटीटी के 150 μl
    • 15 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम
  2. Zymolyase बफर [20 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट (7.4 पीएच), 1.2 sorbitol एम] (100 मिलीलीटर के लिए)
    • 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर के 2 मिलीलीटर (7.4 पीएच)
    • 2 sorbitol एम के 60 मिलीलीटर
    • 100 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम
  3. Homogenization बफर [10 मिमी Tris / एचसीएल (पीएच 7.4), 0.6 एम sorbitol, 1 मिमी EDTA, 0.2% (w / v) BSA] (250 मिलीलीटर के लिए]
    • 1 एम Tris / एचसीएल बफर (7.4 पीएच) के 2.5 मिलीलीटर
    • 2 sorbitol एम के 75 मिलीलीटर
    • 500 मिमी EDTA के 500 μl
    • BSA की 0.5 ग्राम
    • 250 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम
  4. SEM बफर [10 मिमी MOPS / KOH (7.2 पीएच), 250 मिमी sucrose, 1 मिमी EDTA] (250 मिलीलीटर के लिए)
    • 1 एम MOPS KOH / बफर (7.2 पीएच) के 2.5 मिलीलीटर
    • 2 एम sucrose के 31.25 मिलीलीटर
    • 500 मिमी EDTA के 500 μl
    • 250 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम
  5. EM बफर [10 मिमी MOPS / KOH (7.2 पीएच), 1 मिमी EDTA] (250 मिलीलीटर के लिए)
    • 1 एम MOPS KOH / बफर (7.2 पीएच) के 2.5 मिलीलीटर
    • 500 मिमी EDTA के 500 μl
    • 250 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस विधि खमीर कोशिकाओं से उच्च उपज शुद्ध mitochondria के अलगाव के लिए सक्षम बनाता है. इस विधि द्वारा शुद्ध Mitochondria अनिवार्य रूप से अन्य organelles द्वारा संदूषण से मुक्त हैं और उनकी शुद्धि के बाद संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता बनाए रखने. वर्णित विधि के mitochondria की पैदावार है कि आवश्यक mitochondrial प्रक्रियाओं के सेल मुक्त पुनर्गठन के लिए उपयुक्त हैं. ये अत्यधिक शुद्ध mitochondria mitochondrial संरचना और काम करता है, mitochondrial proteome और lipidome, और mitochondrial डीएनए के विश्लेषण के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

यह काम CIHR और कनाडा के NSERC से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. VIT एक CIHR नई अन्वेषक और जीनोमिक्स में Concordia विश्वविद्यालय अनुसंधान चेयर, सेल बायोलॉजी और एजिंग है.

References

  1. Voet, D., Voet, J. G. Biochemistry. , 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2004).
  2. Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J. Mitochondrial dynamics and apoptosis. Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).
  3. Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &, Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
  4. Detmer, S. A., Chan, D. C. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).
  5. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: more than just a powerhouse. Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).
  6. Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. Mitochondria, oxidants, and aging. Cell. 120, 483-495 (2005).

Tags

सेलुलर जीवविज्ञान 30 अंक subcellular fractionation organelles organelle शुद्धि mitochondria
Mitochondria के खमीर कक्ष से शोधन
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko,… More

Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of Mitochondria from Yeast Cells. J. Vis. Exp. (30), e1417, doi:10.3791/1417 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter