וידאו זה יהיה פופולרי colloidal Coomassie G-250 פרוטוקול מכתים פי קאנג<em> Et al.</em> לצורך זיהוי של חלבון 4 ממוצע ng ב ג'לים. מכתים הושלם בתוך 2 שעות ללא כל מאמץ. אנו משתמשים באופן שגרתי פרוטוקול של קאנג למטרות אנליטיות הג'ל מבוסס proteomics.
Abstract
Coomassie מבריק כחול (CBB) הוא צבע נפוץ עבור להדמיה של חלבונים מופרדים על ידי SDS-PAGE, המציע הליך מכתים פשוט quantitation גבוהה. יתר על כן, הוא תואם לחלוטין עם הזדהות המונית חלבון spectrometric. אך למרות יתרונות אלה, CBB נחשב להיות רגישים פחות כסף או stainings הקרינה ולכן רק לעתים נדירות נעשה שימוש לצורך זיהוי של חלבונים הג'ל מבוסס גישות אנליטיות proteomic.
שיפורים אחדים המקורי Coomassie פרוטוקול 1 נעשו כדי להגדיל את הרגישות של CBB. שני השינויים העיקריים שהוכנסו על מנת לשפר את הזיהוי של נמוכה שפע חלבונים ידי המרת מולקולות צבען לחלקיקים colloidal: בשנת 1988 חל נייהוף ועמיתיו מתנול 20% ו ריכוזים גבוהים יותר של אמוניום סולפט לתוך פתרון ה-G-250 מכתים CBB מבוסס 2, ובשנת 2004 Candiano et al. הוקמה כסף כחול באמצעות CBB G-250 עם חומצה זרחתית בנוכחות סולפאט אמוניום, מתנול 3. עם זאת, כל השינויים האלה רק לאפשר זיהוי של חלבון כ 10 ננוגרם. פרוטוקול fameless נרחב מכתים Coomassie colloidal פורסם על ידי קאנג et al. בשנת 2002 שונה שם הם מכתים פרוטוקול colloidal של נייהוף CBB לגבי חומרים complexing. במקום אמוניום סולפט הם השתמשו סולפט אלומיניום מתנול הוחלף 4 אתנול פחות רעיל. אלומיניום מבוסס הרומן מכתים במחקר של קאנג הראו רגישות מעולה שמזהה נמוך כמו 1 ng / להקה (phosphorylase ב) עם וריאציה קצת רגישות בהתאם חלבונים.
הנה, אנחנו מדגימים יישום פרוטוקול של קאנג עבור מכתים מהיר ורגיש Coomassie colloidal של חלבונים למטרות אנליטיות. נדגים את פרוטוקול מהירה וקלה באמצעות דו מימדי ג'לים ביצע באופן שגרתי בקבוצת העבודה שלנו.
Protocol
חלק 1: דו מימדי (2-D) ג'ל אלקטרופורזה באמצעות כוס העמסה IPG-רצועת התייבשות ומיקוד isoelectric (IEF) רעננותם ג'לים Immobiline DryStrip, pH 6-11 (7 ס"מ) בתמיסה 125 התייבשות μl [7 M אוריאה, 2 M thiourea, …
Discussion
חדשני או רק עוד פרוטוקול Coomassie?
כרגע קיימים פרוטוקולים מרובים עבור מכתים נהלים Coomassie כחול מבריק. רובם תוצאה של שינויים קלים או גדולים של אחד הפרוטוקולים הנפוצים ביותר על ידי נייהוף ועמיתיו 2. כמו כן, פרוטוקול של קאנג מבוסס על …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר ניקולה Wiethölter עבור הכנת מכתים של 1-D ג'לים.
עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם דויטשה Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 ל ND ו – SM) ונתמך על ידי מענק מחקר מן Manchot יורגן Stiftung ל ND.
Materials
Name of product
Company
Catalogue No.
Comments
For IEF and SDS-PAGE:
Immobiline DryStrip gels
GE Healthcare
17-6001-94
Can even be used 2 years after expire date.
Immobiline DryStrip Reswelling Tray
GE Healthcare
80-6371-84
Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips.
Immobiline DryStrip Kit
GE Healthcare
18-1004-30
Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups.
EPS 3501 XL Power Supply
GE Healthcare
18-1130-05
Supplies voltage up to 3500 V.
Multiphor II Electrophoresis Unit
GE Healthcare
18-1018-06
Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips)
PerfectBlue gel system Twin S
Peqlab
45-1010-C
SDS-PAGE in 10×10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system.
For colloidal Coomassie G-250 staining:
staining dishes with lids
VWR
216-3412
Fits for mini-gels. Stackable on shaker.
aluminium sulfate-18-hydrate
Merck
1.01102.5000
We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package.
Dyballa, N., Metzger, S. Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels. J. Vis. Exp. (30), e1431, doi:10.3791/1431 (2009).