Summary
Bu video Kang göre kolloidal Coomassie G-250 boyama protokol sevdirmek olacaktır
Abstract
Coomassie Brillant Blue (CBB), genellikle basit bir boyama prosedürü ve yüksek kantitatif sunan SDS-PAGE ile ayrılmış proteinlerin görselleştirme için kullanılan bir boya. Ayrıca, kitle spektrometrik protein kimlik ile tamamen uyumlu. Ancak bu avantajlara rağmen, CBB, gümüş ya da floresan renklendirmeler daha az duyarlı ve bu nedenle analitik jel tabanlı proteomik yaklaşımlar proteinlerin tespiti için kullanılan nadir olarak kabul edilir.
Orijinal Coomassie protokolü 1 CBB duyarlılığını artırmak için bazı geliştirmeler yapılmış. Kolloidal parçacıkları içine boya molekülleri dönüştürerek düşük-bol proteinlerin tespiti geliştirmek için iki önemli değişiklikler getirilmiştir: 1988 yılında, Neuhoff ve arkadaşları CBB G-250 tabanlı boyama çözüm 2,% 20 metanol ve uygulanan yüksek konsantrasyonlarda amonyum sülfat 2004 Candiano ve ark. Mavi Gümüş, fosforik asit, amonyum sülfat ve metanol 3 varlığı ile G-250 CBB kullanarak kuruldu . Bununla birlikte, tüm bu değişiklikler sadece yaklaşık 10 ng protein bir algılama sağlar. Kolloidal Coomassie boyama için yaygın fameless bir protokol Kang ve ark tarafından 2002 yılında yayımlandı. Kompleks maddeler ile ilgili Neuhoff kolloidal CBB boyama protokol değiştirilmiş. Bunun yerine amonyum sülfat, alüminyum sülfat ve metanol yerine daha az toksik etanol 4 kullandı . Roman alüminyum bazlı Kang'ın çalışmada boyama biraz hassasiyet varyasyon proteinleri bağlı olarak 1 ng / bant (fosforilaz b) gibi düşük algılar üstün hassasiyet gösterdi.
Burada, hızlı ve hassas analitik amaçlarla proteinlerin kolloidal Coomassie boyama Kang'ın protokolü uygulaması göstermektedir. Biz rutin çalışma grubunda yapılan iki boyutlu jeller kullanarak hızlı ve kolay bir protokol gösterecektir.
Protocol
Bölüm 1: fincan yükleme kullanarak, iki boyutlu (2-D) jel elektroforezi
- IPG şerit rehidrasyon ve izoelektrik odaklama (IEF)
- 125 ul rehidratasyon çözüm Immobiline DryStrip jeller, pH 6-11 rehidrate (7 cm) [7 M üre, 2 M tiyoüre,% 4 ahbap, 50 mM hydroxyethyldisulfide IPG Tampon pH 6-11 ve% 2] Immobiline DryStrip Reswelling Tepsi en azından 10 saat.
- IEF örnek tampon çöktürülmüş protein örnek çözülür [7 M üre, 2 M tiyoüre,% 2 ahbap, Tampon pH 6-11 IPG ASB-14, 50 mM hydroxyethyldisulfide ve% 2], 100 ul başına 60-100 mg protein karşılık gelen% 2 .
- Çözünürleştirme (oda sıcaklığında en az 30 dakika) sonra, numune kaplarını kullanarak fincan yükleme anodik ile protein örnek geçerlidir. Fincan hacmi 100 ul (Manifold bardak ul 150 kadar izin verin).
Not: hala fincan sıvı bir film varken odaklama protokol ve dolum bardak başında düşük voltajlı bir adım eklerseniz büyük örnek miktarda yükleyebilirsiniz ! - Multiphor II Elektroforez Ünitesi degrade modunda 11.1 KVH için izoelektrik odaklama gerçekleştirin.
- Denge ve SDS-PAGE
- IEF sonra, IPG şeritler, çalkalayıcı dengeleme çözüm sırasıyla% 1 ve% 2.5 dithiothreitol iodoacetamide kullanarak her seferinde 15 dakika azaltılması ve alkilleme tabi tutulmuştur [50 mM Tris-HCl/pH 8.8, 6 M üre,% 30 gliserol ve% 2 SDS].
- H 2 O ile dengelenmiş şeritler durulayın ve aşırı dengeleme tampon kaldırmak için bunları Vatmanlar kağıda kurulayın. Daha sonra SDS çalışan tampon (1X) şeritler daldırma.
- İkinci boyut toplam akrilamid konsantrasyonu% 12 ile dikey elektroforez sistemleri SDS-PAGE ile yapılır. Dengelenmiş IPG şeritleri ayıran jeller üstüne yerleştirilir ve sıcak agaroz çözüm [Bromophenol Mavi içeren tampon çalıştıran% 0.5 agaroz] ile fikse edildi.
- Proteinler, 120 V tarafından takip boya ön jel kaset altına ulaşana kadar 15 dakika için 80 V ile başlayan, 2.5 saat için ayrıldı.
Bölüm 2: G-250 ile CBB Kolloidal Coomassie boyama
1. Boyama çözümler
Not: Millipore sistemleri (Milli-Q su), analitik dereceli (pa) ve yüksek saflıkta su gibi yüksek kalite ile boyama çözümler hazırlanması için kimyasal maddeler kullanmayın.
| Coomassie çözüm: | reklam 2000 ml H 2 O | |
| % 0,02 (w / v) | CBB G-250 | 0,4 g |
| % 5 (w / v) | -hidrat alüminyum sülfat (14-18) | 100 g |
| % 10 (v / v) | etanol (% 96) | 200 ml |
| % 2 (v / v) | ortofosforik asit (% 85) | 47 ml |
Not: boyama çözümün hazırlanması için, aşağıdaki sıraya göre sıralı ek bileşenlerin muhafaza edilmelidir:
- Milli-Q su alüminyum sülfat çözülür
- bundan sonra, etanol ekleyip homojenize ve çözüm CBB G-250 karışımı
- çözüm tamamen eriyene kadar son zamanlarda, fosforik asit (asit dahil alkollü medya onların kolloidal haline agrega Coomassie moleküller sağlar)
- Sonunda Milli-Q su ile doldurmak
Not: son boyama çözüm koyu yeşil-mavi bir görünüme sahiptir ve parçacıkların etrafında yüzme doludur:
- Süzüntü bu çözüm değil!
- Hazırlık amacıyla değiştirdiyseniz, daha az duyarlı bir daha mor-mavi bir çözüm olacaktı.
| Çözüm Destaining: | reklam 2000 ml H 2 O | |
| % 10 (v / v) | etanol (% 96) | 200 ml |
| % 2 (v / v) | ortofosforik asit (% 85) | 47 ml |
2. Prosedürü Boyama
- İkinci boyut ayrıldıktan sonra, cam plakalar dikkatle jeller kaldırmak ve Milli-Q su ile dolu bir boyama çanak içine aktarabilirsiniz.
- Milli-Q su ile jeller üç kere yıkayın yatay bir çalkalayıcı (yetersiz yıkama jelleri kalan SDS, protein, boya sınırlayıcı rahatsız edici olduğundan kötü hassasiyet neden) 10 dakika.
- Coomassie çözüm kolloidal parçacıklar eşit dağıtmak için kullanmadan önce iyice çalkalayın.
- 2-12 saat çalkalayıcı üzerinde ajitasyon Coomassie çözümü ile kaplı jeller inkübe edin. Bu boyama arasında boyama ilerlemeyi gözlemlemek, böylece marjinal arka plan üretir.
Not: 10 dakika sonra ilk protein lekeleri inkübasyon 2 saat içinde yaklaşık% 80, bu boyama görünen görebilirsinizs maksimum düzeyde tamamlandı. Yaklaşık% 100 boyama için, gecelik inkübasyon önerilir. Bazı durumlarda, lekeli protein miktarı çok büyük ve parlak mavi çözüm dönüşür, boyama çözümün bir yenileme gerekli. - Boyama işleminden sonra Coomassie çözüm kaldırmak ve jeller iki kez Milli-Q su ile durulayın.
Not: parçacıkları hala kalan boyama çözüm sürece yeniden kullanabilirsiniz, aksi takdirde (laboratuvar atık bertarafı için özel düzenlemeler olabileceğini akılda tutmak) atın. - Boya taneciklerini yapıştırarak, tüy bırakmayan bir kağıt havlu ile leke tabağına çıkartın ve destain 10 - 60 dakika.
Not: Ayrıca jeller sadece Milli-Q su ile yıkayabilirsiniz ama tarama işlemi sırasında ortaya çıkacak jeller üzerinde düzensiz, zayıf Coomassie film sürecek, çünkü bu bizim için sadece hazırlık jeller tavsiye . - Son olarak Milli-Q su ile iki kez jeller durulama: jeller orijinal kalınlığına ulaşmak (alkol-asit ortam jeller daralma yapar) ve su nötralizasyon ek Coomassie renk yoğunluğunu artırır.
Bölüm 3: Temsilci sonuçları
Yukarıda açıklanan protokol takip ederseniz, 2-D jel ayırt edici giderilmiş ve iyi lekeli koyu mavi protein noktalar olsun. Hatta Shevchenko ve arkadaşları 5, kütle spektrometresi ile iyi bir duyarlılık ve uyumluluk iddia eden bir protokoldür göre gümüş lekeli bir 2-D jel göre, biz eşit boyama sonuçları elde etmek .
Şekil 1: Yukarıda açıklanan deney Nihai sonuç. Kang'ın Coomassie protokolü (A), Shevchenko ve arkadaşları göre gümüş boyama gibi güçlü bir şekilde gerçekleştirir. (B) 2-D jel elektroforezi sonra proteinleri tespit .
Bölüm 4: İpuçları ve püf noktaları
- Kendi örnekleri işlemeden önce bazı test renklendirmeler gerçekleştirin. Açıklanamaz nedenlerden dolayı bir ilgi protein başarıyla miligram uygulandı bile tespit edilebilir olabilir bazen bildirdi. Bu durumda biz duyarlılık test etmek için bazı seyreltme bir dizi hazırlamak için önerilir.
- SDS-PAGE sırasında ayıran jel istifleme genel başarısız transfer protein jel algılama (ler) düşük varsa muhtemelen sebep olacaktır. Istifleme alanı da dahil olmak üzere tam jel boyama gibi yapışkan proteinlerin kontrol edebilirsiniz.
- Izoelektrik odaklama sonuçları hızlı bir doğrulama için, doğrudan başka bir ikinci boyut ayırımı olmadan IPG-şeritler leke yapabilir.
- (Jeller karşı kayıtsız devam ederseniz, boya jel bir tarafa bağlanır), her iki taraftan eşit şekilde boyanmış böylece Bazen boyama işlemi sırasında jeller açmak.
- Biz karanlık bir şişe boyama çözüm (4 aya kadar şeffaf şişelerde) depolama ömrünü artırır yaşadı.
- Boyama ve belgeleyen (asidik eklerseniz mantarlar tarafından Bulaşmayı önlemek) jeller birkaç yıl boyunca buzdolabında tutabilirsiniz sonra.
- Triptik sindirmek için jel fişlerinin Destaining bir blok ısıtıcı ısınmanın hızlandırılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yenilikçi ya da sadece başka bir Coomassie protokol?
Şu anda Coomassie Brillant Blue prosedürleri boyama için birden fazla protokol var. Çoğu Neuhoff ve meslektaşları 2 tarafından en yaygın olarak kullanılan protokoller küçük veya büyük değişiklikler sonucu. Ayrıca Kang'ın protokolü Neuhoff formülü dayanmaktadır. Ama gerçekten proteomik araştırma için alternatif Coomassie boyama yöntemi nedir? Biz diğer Coomassie protokolleri ve hatta gümüş ve floresan renklendirmeler ile karşılaştırıldığında kesinlikle faydalı bir boyama protokolü dair kanıt, iki ana konular, algılama limiti ve kullanılabilirlik resmi olacak.
Odak: tespit limiti
Kang yayın, 1 ng / bant (Şekil 2) için çeşitli protein işaretleyicileri tespit. Fakat bizim düşüncemize göre 4-8 ng / bant bir saptama sınırı daha çok uygulama (Tablo 1) ile ilgili. Onlar daha kolloidal bir Coomassie protokolü hem de ilgili olarak üstün hassasiyet seviyesi görüştü CBB, fosforik asit, amonyum sülfat ve metanol ve Amersham Pharmacia Biyoteknoloji asidik bir gümüş boyama (Leke Gümüş Plus Kiti) G-250 .
Şekil 2: Temsilcisi SDS-jel tarafından yayınlanan Kang ve ark. değiştirilmiş CBB-G250 protokol gücünü gösterir. 250 ng / grup proteinler, ard arda sağ tarafına seyreltilmiş en sol ve 2 kat yüklendi.
Tablo 1: protein tespiti için daha gerçekçi bir eşik karşılaştırma Kang'ın yayın alınan standart proteinler için sınırlar Boyama.
| Protein | MW [kDa] | Protein miktarı [ng] (sanal vs ciddi) |
| miyozin | 220 | 1 / 4 |
| b-galaktosidaz | 116 | 1 / 4 |
| fosforilaz b | 97 | 1 / 4 |
| sığır serum albumini | 66 | 2 / 4 |
| ovalbumin | 45 | 4 / 8 |
Bu algılama sınırları onaylamak için ve daha Kang'ın boyama yöntemi doğrulamak için biz SYPRO Ruby (BioRad) ve Deep Purple (GE Healthcare) (şekil gibi piyasada bulunan floresan boyama çözümleri tarafından tespit edilen moleküler ağırlık belirteçler ile ortak Laemmli SDS-jeller bizim kendi testi serisi gerçekleştirilen 3). İlginçtir ki, iyi ya da Kang'ın boyama puanları daha iyi performans (Deep Purple) ve bu nedenle işçi giriş ve performans açısından kesinlikle üstündür!
Şekil 3: Kang ile SYPRO Ruby (B) ve Deep Purple (GE Healthcare) (Şekil 3) CBB-G250 tabanlı boyama (A) karşılaştırılması. (C) SDS-PAGE protein bantları boyama. Fosforilaz b (97.4 kDa), BSA (66.2 kDa), ovalbumin (45 kDa), karbonik anhidraz (31 kDa), soya tripsin inhibitörü (21.5 kDa) ve lizozim (14.4 kDa) içeren bir moleküler ağırlık marker protein miktarları ile analiz edildi 1 g / jel sol tarafındaki bant ve ard arda sağ 2 kat seyreltilmiş.
Bununla birlikte, bu algılama sınırları molekül ağırlığı işaretleri için kullanılan ve dikkatle düşünülmelidir standart proteinler ile tespit edildi. Bu nedenle, ayrıca kısmen zayıf afinitesi CBB (örneğin fetuin, bil) farklı proteinler ile Kang'ın boyama yöntemi test etti. Şekil 4'te gösterildiği gibi, Kang'ın protokolü geleneksel CBB boyama üstün ve hatta SYPRO Ruby daha iyi yapar, ama bu durumda gümüş boyama gelmez. Ancak, biz Kang modifiye boyama yöntemi hassas ve hızlı protein jel bazlı proteomik tespitleri için olağanüstü bir alternatif olduğuna inanıyorum.
Şekil 4: karşılaştırıldığında (A) Kang'ın kolloidal Coomassie protokolü (destaining olmadan) ile fetuin, Protein boyama (B) geleneksel bir CBB G-250 boyama (40% metanol ve% 10 asetik asit), (C) SYPRO Ryby ve (D Shevchenko ve ark göre) gümüş boyama. SDS-PAGE 2 ng kadar sulandırılmış 2 g protein miktarları yüklendi.
Focus II: kullanışlılık
Gelişmiş algılama sınırları dışında Kang'ın Coomassie protokolü Neuhoff veya Candiano renklendirmeler ve hatta floresan protokolleri doğru tercihli kılan birçok özellik sunuyor:
- sabitleme ve boyama bir adım yapılır
- değil en fazla 4 adım
- ilk boyama sonuçları hızlı şekilde görünür (çoğu durumda az 20 dakika içinde)
- prosedür boyama% 80 tamamlanması için sadece 2 saat gerektirir.
- sadeceminimal arka plan boyama
- boyama işlemi (bir bitiş noktası yöntemiyle) çok tekrarlanabilir.
- toksik alkol ile (metanol, etanol yerine daha kullanım)
- çözüm hemen hemen kokusuz (asetik asit hiçbir)
- düşük konsantrasyonlarda G-250 CBB kullanın.
Özetle, formül, göreceli olarak Tehlikesiz katkılar ihtiva eden, çevre dostu ve ucuz, oldukça rahat. Ayrıca Kang'ın boyama kütle spektrometresi analizleri ile tamamen uyumlu. Sonunda bir Kang'ın Coomassie boyama proteinlerin proteomik temelli yaklaşımlar için bile hızlı ve analitik bir jel tespiti için mükemmel olduğunu söyleyebilirim.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ifşa etmek için hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Dr. Nicola Wiethölter Biz 1-D jellerin hazırlanması ve boyama için teşekkür ederiz.
Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (ND ve SM GRK 1089/project 5) hibe tarafından finanse edilen ve ND için Stiftung Jürgen Manchot bir araştırma bursu ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immobiline DryStrip gels | GE Healthcare | 17-6001-94 | Can even be used 2 years after expire date. |
| Immobiline DryStrip Reswelling Tray | GE Healthcare | 80-6371-84 | Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups. |
| EPS 3501 XL Power Supply | GE Healthcare | 18-1130-05 | Supplies voltage up to 3500 V. |
| Multiphor II Electrophoresis Unit | GE Healthcare | 18-1018-06 | Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips) |
| PerfectBlue gel system Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE in 10x10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system. |
| staining dishes with lids | VWR international | 216-3412 | Fits for mini-gels. Stackable on shaker. |
| aluminium sulfate-18-hydrate | Merck & Co., Inc. | 1.01102.5000 | We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package. |
| orthophosphoric acid | Prolabo | 20 624.295 | Sold in glass bottles. |
References
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).
- Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).
