Summary
이 동영상은 강호에 따라 콜로이드 쿠매시 G - 250 얼룩 프로토콜을 대중화한다
Abstract
쿠매시 블리언트 블루 (CBB)은 일반적으로 간단한 얼룩 절차 및 높은 quantitation를 제공 SDS - PAGE로 구분하여 단백질의 시각화에 사용되는 염료입니다. 또한, 그것은 대량 spectrometric 단백질 식별와 완벽하게 호환됩니다. 그러나 이러한 장점에도 불구하고, CBB는 은색 또는 형광 stainings보다 민감하고 따라서 분석 젤 기반 proteomic 접근에서 단백질의 검출에 사용되는 거의 없습니다 것으로 간주된다.
원래 쿠매시 프로토콜 1 몇 가지 개선 CBB의 감도를 증가되었습니다. 두 대대적인 개조가 콜로이드 입자로 염료 분자를 변환하여 낮은 풍부한 단백질의 검출을 향상시키기 위해 도입되었습니다 : 1988 년, Neuhoff와 동료는 CBB G - 250을 기반으로 얼룩 솔루션 2에 20 % 메탄올 및 암모늄 황산의 높은 농도를 적용 2004 Candiano 외 인치 암모늄 황산과 메탄올 3의 존재에있는 인산과 CBB G - 250을 사용하여 블루 실버를 설립하였습니다. 그럼에도 불구하고, 모든 수정은 약 10 NG 단백질의 검출을 허용합니다. 콜로이드 쿠매시의 얼룩에 대해 광범위하게 fameless 프로토콜은 강 외에 의해 출판되었다. 2002 년 그들은 complexing 물질에 관한 Neuhoff의 콜로이드 CBB의 얼룩 프로토콜을 수정 곳. 대신 암모늄 황산의 그들은 황산 알루미늄과 메탄올이 적은 독성 에탄올 4로 대체되었다를 사용합니다. 소설 알루미늄 기반의 강호의 연구에 얼룩이 약간 감도 유사 단백질에 따라 1 NG / 밴드 (phosphorylase B)처럼 낮은 감지 우수한 감도를 보여주었다.
여기서는 분석 목적에 단백질의 신속하고 민감한 콜로이드 쿠매시의 얼룩을 위해 강호의 프로토콜의 응용 프로그램을 보여줍니다. 우리는 일상적으로 우리의 작업 그룹에서 수행 2 차원 젤을 사용하여 빠르고 쉽게 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
1 부 : 컵 로딩을 사용하여 2 차원 (2 - D) 겔 전기 영동
- IPG - 스트립 rehydration과 isoelectric 초점 (IEF)
- 125 μl rehydration 솔루션의 Immobiline의 DryStrip의 젤, 산도 6-11을 (7cm) Rehydrate [7 M 우레아, 2 M 티오 우레아, 4 % 챕스, 버퍼 산도 6-11을 IPG 50 MM의 hydroxyethyldisulfide 2 %]에 대한 Immobiline DryStrip Reswelling 트레이를 사용하여 적어도 10 시간.
- IEF 샘플 버퍼 시켰던 단백질 샘플을 디졸브 [7 M 우레아, 2 M 티오 우레아, 2 % 챕스, 2% 버퍼 산도 6-11 IPG ASB - 14, 50 MM의 hydroxyethyldisulfide 2 %] 100 μl 당 60-100 μg의 단백질에 대응을 .
- solubilization (상온에서 최소 30 분) 후, 샘플 컵을 사용하여 컵 로딩 양극을 통해 단백질 샘플을 적용합니다. 컵의 볼륨은 100 μl입니다 (매니폴드 컵 150 μl까지 허용).
참고 : 컵에 액체 필름 아직 거기있는 동안 당신이 초점을 프로토콜과 리필 종이컵의 시작 부분에서 낮은 전압 단계를 삽입하는 경우가 더 큰 예제 금액을 로드할 수 있습니다! - Multiphor II 전기 영동 단위의 기울기 모드에서 11.1 kVh에 대한 초점을 isoelectric을 수행합니다.
- 평균 및 SDS - PAGE
- IEF 후, IPG 스트립은 평균 솔루션에 각각 1 % dithiothreitol과 2.5 %의 iodoacetamide를 사용하여 쉐이크에 대한 때마다, 감소와 알킬화 15 분 대상이되었다 [50 MM Tris-HCl/pH 8.8, 6 M 우레아, 30 % 글리세롤 그리고 2% SDS].
- H 2 O와 equilibrated 스트립을 씻어 초과 평형의 버퍼를 제거하는 왓먼 종이에 그들을 얼룩. 이후 SDS 실행 버퍼 (1X)에 부착된을 찍어.
- 두 번째 차원은 12 %의 총 아크릴 아미드의 농도와 수직 전기 영동 시스템에 대한 SDS - PAGE에 의해 수행됩니다. equilibrated IPG 스트립이 분리 젤의 상단에 위치하고 뜨거운 아가로 오스 솔루션 [bromophenol 블루가 포함된 버퍼 실행에 0.5 % 아가로 오스]를 함께 해결되었습니다.
- 단백질은 염료 전면 겔 카세트의 바닥에 도달할 때까지 120 V 다음에 15 분 동안 80 V에서 시작, 2.5 시간을 위해 분리되었다.
2 부 : CBB G - 250로 콜로이드 쿠매시의 염색법
1. 얼룩 솔루션
참고 : Millipore 시스템 (밀리 Q 물)에서 얻을로 얼룩 솔루션의 준비를 위해 이러한 분석 학년 (PA) 및 고순도의 물 같은 높은 품질의 화학 물질을 사용합니다.
| 쿠매시 솔루션 : | 광고 2000 ML H 2 O | |
| 0.02 % (W / V) | CBB G - 250 | 0,4 g |
| 5 % (W / V) | 황산 알루미늄 - (14-18) 수화물 | 100g |
| 10 % (V / V) | 에탄올 (96 %) | 200 ML |
| 2퍼센트 (V / V) | orthophosphoric 수 소산 (85 %) | 47 ML |
참고 : 얼룩 솔루션의 준비를 위해, 다음과 같은 순서로 구성 요소의 연속적인 덧셈 유지되어야합니다 :
- 첫째 밀리 Q 물에 황산 알루미늄을 풀다
- 이후, 에탄올을 추가 균질하고 솔루션에 CBB G - 250 믹스
- 솔루션이 완전히 해소에 버금가는 최근, 인산을 (알코올 미디어 산성의 결합들은 콜로이드 상태로 집계 쿠매시 분자를 수) 추가
- 결국 밀리 Q의 물을 채워
참고 : 최종 얼룩 솔루션은 어두운 녹색 푸른빛이 도는 모양을 가지고 있으며, 주변에 수영 입자 가득합니다 :
- 여과액이 솔루션은하지 마!
- 이 준비의 순서를 변경하는 경우, 당신은 덜 민감보다 바이올렛 - 푸르스름한 솔루션을 얻을 것입니다.
| 솔루션을 Destaining : | 광고 2000 ML H 2 O | |
| 10 % (V / V) | 에탄올 (96 %) | 200 ML |
| 2퍼센트 (V / V) | orthophosphoric 수 소산 (85 %) | 47 ML |
2. 절차를 염색법
- 두번째 차원 분리 후, 조심스럽게 유리 접시에서 젤류를 제거하고 밀리 Q 물로 가득 얼룩 그릇에 그들을 전송합니다.
- 수평 흔드는 (젤에 남아있는 SDS는 단백질에 대한 염료의 경계를 방해하기 때문에 부족한 세탁은 가난한 감도의 원인)에 10 분간 밀리 Q 물로 젤 세 번 씻으십시오.
- 고르게 콜로이드 입자를 분산하는 데 사용하기 전에 쿠매시 솔루션을 흔들어.
- 잘 2~12시간 위해 쉐이크에 교반하여 쿠매시 솔루션으로 덮여 젤을 품어. 이 사이에있는 얼룩의 진행 상황을 볼 수 있도록이 얼룩은 한계 배경을 생성합니다.
참고 : 10 분 후 먼저 단백질의 명소가 부화 2 시간 이내에, 그것에 얼룩 약 80 %를 게재 볼 수 있습니다S 최대 레벨이 완료됩니다. 거의 100 % 얼룩 경우, 하룻밤 배양하는 것이 좋습니다. 어떤 경우에는 스테인드하는 단백질의 양이 거대하며 솔루션은 밝은 청색으로 변하기 때, 얼룩 솔루션의 새로 고침이 필요합니다. - 얼룩 절차 후 쿠매시 솔루션을 제거하고 밀리 Q 물로 두 번 젤을 씻어.
참고 : 입자가 아직 남아 있으므로이 한 얼룩 솔루션을 재사 용할 수, 그렇지 않으면 (귀하의 연구실은 폐기물 처리에 대한 특별한 규정이있을 수 있습니다 것을 명심하십시오)를 폐기하십시오. - 보푸라기가없는 종이 타월로 얼룩 접시에서 염료 입자를 집어넣는 제거하고 10 destain - 60 분.
참고 : 또한 단지 밀리 Q 물로 젤을 씻을 수 있지만 스캔 절차를 수행하는 동안 발생할 것입니다 젤에 불규칙적인, 약한 쿠매시 필름이 지난 있기 때문에 이것은 우리가 예비 젤에 대해서만하는 것이 좋습니다. - 마지막으로 밀리 Q 물로 두 번 씻어 젤 : 젤 원래 두께에 도달 (알코올 산성 미디어 젤의 축소를 만드는)와 중화 물 속에서 또한 쿠매시의 색상 강도를 향상됩니다.
파트 3 : 대표 결과
당신은 위에서 설명한 프로토콜을 따른다면 당신은 2 - D 젤 특유의 해결을 잘 스테인드 진한 파란색 단백질 명소에 얻을 것이다. 심지어 쉐브첸코 외. 5, 질량 분광법과 좋은 감도와 호환성을 주장하는 프로토콜에 따라 은색 물들일 2 - D 겔에 비해, 우리는 동등한 얼룩 결과를 얻을 수 있습니다.
그림 1 : 위에서 설명한 실험의 최종 결과. 강의 쿠매시 프로토콜 (A)는 쉐브첸코 외에 따라 은빛 얼룩처럼 강력하게 수행합니다. (B) 2 - D 겔 전기 영동 후 단백질을 검출 인치
부 4 : 팁 및 유용한 정보
- 자신의 샘플을 처리하기 전에 몇 가지 테스트 stainings을 수행합니다. 설명할 이유로 우리는 밀리그램이 적용되었습니다 때에도 관심의 단백질이 성공적으로 감지되지 않을 수 가끔 보도했다. 이 경우에는 우리는 감도를 테스트하는 몇 가지 희석 시리즈를 준비하는 것이 좋습니다.
- 당신은 SDS - PAGE 동안 분리 겔에 스태킹에서 일반적으로 실패 전송의 단백질 인 겔 감지 (들)을 낮은이있다면 아마도 그 이유 것입니다. 당신은 스태킹 지역을 포함한 전체 젤 얼룩하여 이러한 끈적끈적한 단백질에 대한 확인하실 수 있습니다.
- 귀하의 isoelectric 초점 결과의 빠른 확인을 위해, 당신은 바로 더 둘째 차원 분리하지 않고 IPG - 스트립을 얼룩 수 있습니다.
- 그들은 (당신이 젤은 냉정한 유지하면 염료 그냥 젤의 한쪽에 바인딩) 양쪽에서 균등하게 스테인드하므로 때때로 얼룩 절차를 수행하는 동안 젤을 켜십시오.
- 우리는 그 어두운 병에 얼룩 솔루션 스토리지 (4 개월 최대 투명 병에)의 수명을 증가가 발생했습니다.
- 얼룩 및 (가 산성 솔루션을 추가하는 경우가 곰팡이에 의해 contaminations을 피할) 몇 년 동안 냉장고에 젤을 유지할 수 문서화 후.
- tryptic 다이제스트에 대한 겔 플러그의 Destaining은 블록 히터의 온난화에 의해 가속 수 있습니다.
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Discussion
혁신 아니면 그냥 다른 쿠매시 프로토콜?
현재 쿠매시 브릴리언트 블루와 절차를 얼룩에 대해 여러 개의 프로토콜이 존재. 그들의 대부분은 Neuhoff 및 동료 2에서 가장 일반적으로 사용되는 프로토콜 중 하나의 미성년자 또는 대대적인 개조로 인한. 또한 강의 프로토콜은 Neuhoff의 공식에 따라. 하지만 정말 proteomic 연구에 대안 쿠매시의 얼룩 방법인가요? 우리는 다른 쿠매시 프로토콜 심지어 은과 형광등 stainings에 비해 확실히 유익한 얼룩 프로토콜의 증거로, 두 가지 주요 문제, 검색 제한 및 가용성을 그림 것입니다.
I 포커스 : 검출 한계를
강의 출판, 그들은 1 NG / 밴드 (그림 2) 여러 마커 단백질을 발견했습니다. 그러나 우리의 의견에 4-8 NG / 밴드의 검출 한계는 가능성이 더 높습 연습 (표 1)과 관련이 있습니다. 그들은 추가로 콜로이드 쿠매시 프로토콜 모두에 관련하여 우수한 감도 수준을 논의 CBB 인산 암모늄 황산과 메탄올과 아머샴 Pharmacia 생명 공학에서 산성 실버 얼룩 (스테인 실버 플러스 키트)에서 G - 250.
그림 2 : 대표 SDS - 겔 강 외 의해 출판. 그 수정된 CBB - G250 프로토콜의 성능을 보여줍니다. 250 NG / 밴드 단백질은 연속적으로 오른쪽으로 희석 가장 왼쪽 2 배에서로드되었습니다.
표 1 : 단백질 검출을위한보다 현실적인 한계에 비해 강호의 간행물에서 발췌한 표준 단백질에 대한 한계를 스테 이닝.
| 단백질 | MW [KDA] | 단백질 금액 [NG] (가상 대 심각) |
| 마이 오신 | 220 | 4분의 1 |
| B - galactosidase | 116 | 4분의 1 |
| phosphorylase B | 97 | 4분의 1 |
| 소 혈청 알부민 | 66 | 4분의 2 |
| ovalbumin | 45 | 8분의 4 |
이러한 검출 한계를 확인하고 더 캉의 얼룩 방법의 유효성을 검사하기 위해 우리는 Sypro 루비 (BioRad)과 딥 퍼플 (GE 헬스케어) (그림과 같은 상용 형광 염색법 솔루션에 의해 감지 분자량 마커와 일반 Laemmli SDS - 젤에 대한 자체 테스트 시리즈를 수행 3). 흥미롭게도, 물론 심지어는 강호의 얼룩 점수는 더 나은 성능 (딥 퍼플의 경우) 따라서 노동 입력 및 성능 면에서 확실히 우수합니다!
그림 3 : Sypro 루비 (B)과 딥 퍼플 (GE 헬스케어) (그림 3)과 강호의 CBB - G250 기반의 얼룩 (A)의 비교. SDS - PAGE에서 단백질 밴드 (C) 염색법. phosphorylase B (97.4 KDA), BSA (66.2 KDA), ovalbumin (45 KDA), 탄소 anhydrase (31 KDA), 대두 트립신 억제제 (21.5 KDA)와 라이 소 자임을 (14.4 KDA)이있는 분자량 마커는 단백질 금액으로 분석되었다 1 젤의 왼쪽에서 G / 밴드와 연속적으로 오른쪽으로 2 배 희석.의
그럼에도 불구하고, 이러한 검출 한도는 분자량 마커에 대한 사용주의와 함께 고려되어야 표준 단백질로 결정됩니다. 이러한 이유로, 우리는 또한 일부 CBB (예 : fetuin, mycin)에 약한 바인딩 친화력을 가지고 서로 다른 단백질과 강호의 얼룩 방법을 테스트했습니다. 그림 4 시연, 캉의 프로토콜은 기존의 CBB의 얼룩에 뛰어난하고 심지어 Sypro 루비보다 수행하지만,이 경우에 실버 얼룩까지 오지 않습니다. 그러나, 우리는 강호의 수정된 얼룩 방법이 젤 기반 proteomics에 민감하고 빠른 단백질 탐지에 대한 뛰어난 대안 믿습니다.
그림 4 : 비교 (A) 강호의 콜로이드 쿠매시 프로토콜 (destaining 제외)과 fetuin의 단백질 얼룩 (B) 종래의 CBB G - 250 염색법 (40 % 메탄올와 10 % 아세트산), (C) Sypro Ryby와 (D 쉐브첸코 외에 따라) 실버 염색법. 이 NG까지 희석 2g의 단백질 금액은 SDS - PAGE에 대해로드되었습니다.
포커스 II : 가용성
향상된 검출 한계 옆에 강스 쿠매시 프로토콜 Neuhoff 또는 Candiano의 stainings 심지어 형광 프로토콜을 향해 그것이 우선하게 몇 가지 기능을 제공 않습니다
- 고정 및 얼룩 것은 한 번에 이루어집니다
- 모두 안 이상 4 단계
- 첫째 얼룩 결과가 빠르게 표시됩니다 (대부분의 경우 20 분 이내)
- 절차는 얼룩의 80 % 완료에 대해서만 2 시간 필요
- 막최소한의 배경 염색법
- 얼룩 절차는 (이것은 종점 방법입니다) 매우 재현할 수있다
- 독성 알코올로 더 이상 취급하지 (메탄올은 에탄올로 대체됩니다)
- 이 솔루션은 거의 무취입니다 (초산없이 사용)
- 낮은 농도에서 CBB G - 250 중 하나를 사용하십시오.
요약, 수식은 상대적으로 nonhazardous, 환경 친화적이고 저렴한 매우 편리합니다. 또한 강의 얼룩은 질량 분석계 분석과 완벽하게 호환됩니다. 결국 하나는 강호의 쿠매시의 얼룩도 proteomics 기반의 접근 방식에 대한 단백질의 신속하고 분석 인 겔 감지 우수하다고하실 수 있습니다.
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Disclosures
나는 공개 없어요.
Acknowledgments
우리는 1 차원 젤의 준비와 얼룩에 대한 박사 니콜라 Wiethölter 감사합니다.
이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (ND와 SM에 GRK 1089/project 5)에서 부여로 투자 및 ND에 Stiftung 위르겐 만촛에서 연구 활동에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immobiline DryStrip gels | GE Healthcare | 17-6001-94 | Can even be used 2 years after expire date. |
| Immobiline DryStrip Reswelling Tray | GE Healthcare | 80-6371-84 | Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups. |
| EPS 3501 XL Power Supply | GE Healthcare | 18-1130-05 | Supplies voltage up to 3500 V. |
| Multiphor II Electrophoresis Unit | GE Healthcare | 18-1018-06 | Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips) |
| PerfectBlue gel system Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE in 10x10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system. |
| staining dishes with lids | VWR international | 216-3412 | Fits for mini-gels. Stackable on shaker. |
| aluminium sulfate-18-hydrate | Merck & Co., Inc. | 1.01102.5000 | We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package. |
| orthophosphoric acid | Prolabo | 20 624.295 | Sold in glass bottles. |
References
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).
- Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).
