Snabb och känslig Kolloidal Coomassie G-250 Färgning för proteiner i polyakrylamidgeler

Summary

Denna video ska popularisera en kolloidal Coomassie G-250 färgningsprotokollet enligt Kang

Abstract

Coomassie Brilliant Blue (CBB) är ett färgämne som ofta används för visualisering av proteiner separeras med SDS-PAGE, som erbjuder ett enkelt färgningsproceduren och hög kvantifiering. Dessutom är det helt kompatibelt med masspektrometrisk protein identifiering. Men trots dessa fördelar är CBB anses vara mindre känsliga än silver eller fluorescens stainings och därför sällan används för detektion av proteiner i analytisk gel-baserad proteomik strategier.

Flera förbättringar av den ursprungliga Coomassie protokoll ¹ har gjorts för att öka känsligheten för CBB. Två större förändringar infördes för att förbättra upptäckten av låga rikliga proteiner genom att konvertera färgen molekyler i kolloidala partiklar: År 1988 tillämpade Neuhoff och kollegor 20% metanol och högre halter av ammonium sulfat i CBB G-250 baserad färglösning ^2, och 2004 Candiano et al. etablerade Blå Silver med CBB G-250 med fosforsyra i närvaro av ammoniumsulfat och metanol ^3. Trots alla dessa ändringar kan bara en upptäckt av cirka 10 ng protein. En allmänt fameless protokoll för kolloidala Coomassie färgning publicerades av Kang et al. År 2002 där de ändrade Neuhoff är kolloidal protokoll CBB färgning om komplexbildande ämnen. Istället för ammoniumsulfat de använde aluminiumsulfat och metanol ersattes av den mindre giftiga etanol ^4. Den nya aluminium-baserade färgning i Kangs studie visade överlägsen känslighet som upptäcker så lågt som 1 ng / bandet (phosphorylase b) med liten känslighet varierar beroende på proteiner.

Här visar vi tillämpa Kangs protokoll för snabba och känsliga kolloidala Coomassie färgning av proteinerna i analytiska ändamål. Vi kommer att illustrera den snabba och enkla protokoll med hjälp av tvådimensionella geler rutinmässigt i vår arbetsgrupp.

Protocol

Del 1: Två-dimensionella (2-D) gelelektrofores med cup-loading

1. IPG-strip rehydrering och isoelektrisk fokusering (IEF)
   • Rehydrera Immobiline DryStrip geler, pH 6-11 (7 cm) i 125 l vätskeersättning [7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 50 mm hydroxyethyldisulfide och 2% IPG pH 6-11] med Immobiline DryStrip Reswelling fack för minst 10 timmar.
   • Lös fälls protein provet i IEF prov buffert [7 M urea, 2 M tiourea, 2% käkar, 2% ASB-14, 50 mm hydroxyethyldisulfide och 2% IPG pH 6-11] vilket motsvarar 60-100 mikrogram protein per 100 l .
   • Efter lösningsgörande (minst 30 minuter vid rumstemperatur), gäller protein prov via anodiska cup-lastning med provkoppar. Volymen av koppen är 100 l (Manifold koppar kan ta upp till 150 l).
     Obs: du kan ladda större urval belopp om du sätter en låg spänning steg i början av fokus protokoll och fyll kopparna medan det fortfarande finns en vätskefilm i koppen!
   • Utför isoelektrisk fokusering på 11,1 KVH i lutning läge i Multiphor II elektroforesenheten.
2. Uppnå jämvikt och SDS-PAGE
   • Efter IEF var IPG remsor behandlats för att minska och alkylering, varje gång 15 minuter på en shaker, med 1% ditiotreitol och 2,5% iodoacetamide respektive i jämviktslösning [50 mM Tris-HCl/pH 8,8, 6 M urea, 30% glycerol och 2% SDS].
   • Skölj jämvikt remsorna med H ₂ O och blot dem på Whatman papper för att avlägsna överflödig jämvikt buffert. Efteråt Doppa remsorna i SDS-running buffert (1X).
   • Den andra dimensionen utförs av SDS-PAGE på en vertikal elektrofores system med en total akrylamid koncentration på 12%. Den jämvikt IPG remsor placerades på toppen av separera geler och fast med varmt agaroslösningen [0,5% agaros i löpande buffert innehållande Bromfenolblått].
   • Proteiner skildes för 2,5 timmar, med start vid 80 V under 15 minuter följt av 120 V tills färgen når botten av gelen kassetten.

Del 2: Kolloidal Coomassie färgning med CBB G-250

1. Färgning lösningar
Obs: för beredningen av färgning lösningar, använda kemikalier med hög kvalitet som analytisk renhet (pa) och vatten med hög renhet som du får från Millipore system (Milli-Q Water).

Coomassie lösning:		AD 2000 ml H 2 O
0,02% (w / v)	CBB G-250	0,4 g
5% (w / v)	aluminiumsulfat-(14-18)-hydrate	100 g
10% (v / v)	etanol (96%)	200 ml
2% (v / v)	ortofosforsyra (85%)	47 ml

Obs: för beredning av färglösningen har sekventiell tillsättning av komponenterna i följande ordning skall upprätthållas:

1. first upplösa aluminiumsulfat i Milli-Q Water
2. därefter lägga till etanol, homogenisera och blanda CBB G-250 till lösningen
3. så sent som lösningen är helt upplöst, tillsätt fosforsyra (införlivandet av syran till alkoholhaltiga media låter Coomassie molekylerna samlade i sin kolloidala tillstånd)
4. äntligen fylla på med Milli-Q Water

Obs: den slutgiltiga färglösningen har en mörk grön-blåaktig utseende och är full av partiklar simmar omkring:

• Inte filtratet denna lösning!
• Om du har ändrat ordningen för beredning, skulle du få en mer violett-blå-lösning som är mindre känsliga.

Avfärgningslösning:		AD 2000 ml H 2 O
10% (v / v)	etanol (96%)	200 ml
2% (v / v)	ortofosforsyra (85%)	47 ml

2. Färgningsproceduren

• Efter andra dimension separation, försiktigt bort gel från glasplåtar och överföra dem till en färgning skål fylld med Milli-Q Water.
• Tvätta geler tre gånger med Milli-Q vatten i 10 minuter på en horisontell skakapparat (otillräcklig tvätt orsakar dålig känslighet på grund av att återstående SDS på geler stör begränsningsramen av färgämnet till proteinet).
• Skaka Coomassie lösningen före användning för att skingra kolloidala partiklar jämnt.
• Inkubera geler väl täckt med Coomassie lösning genom agitation på en shaker i 2-12 timmar. Denna färgning genererar marginella bakgrunden så att du kan observera färgning framsteg i mellan.
  Observera: efter 10 minuter kan du se första protein fläckar förekommer, inom 2 timmar efter inkubation ca 80% färgning till dets maximala nivån är klar. För nästan 100% infärgning är natten inkubation rekommenderas. I vissa fall, när mängden protein som ska färgas är enorm och lösningen förvandlas till en ljus blå, är en uppdatering av färglösningen nödvändigt.
• Efter färgningsproceduren bort Coomassie lösningen och skölj geler två gånger med Milli-Q Water.
  Notera: Du kan återanvända färglösningen så länge partiklar är fortfarande kvar, annars kasta den (kom ihåg att ditt laboratorium kan ha särskilda regler för avfallshantering).
• Ta bort fastnar färgämnet partiklar från färgning rätt med en luddfri pappershandduk och Avfärga för 10 - 60 minuter.
  Notera: Du kan även tvätta geler bara med Milli-Q Water men vi rekommenderar endast för förberedande geléer eftersom det kommer att pågå i en oregelbunden, svag Coomassie film på geler som kommer att uppstå vid undersökningen.
• Slutligen skölj geler två gånger med Milli-Q Water: gelen kommer att nå sin ursprungliga tjocklek (alkohol-syra media gör geler krympande) och neutralisering i vatten dessutom ökar Coomassie färg intensitet.

Del 3: representativa resultat

Om du följer det protokoll som beskrivs ovan får du på din 2-D gel distinkta lösas och väl färgas mörkblå protein fläckar. Även jämfört med en 2-D gel färgas med silver efter Shevchenko et al. ^5, ett protokoll som hävdar bra känslighet och kompatibilitet med masspektrometri, uppnår vi lika färgning resultat.

Figur 1: Slutligt resultat av experiment som beskrivs ovan. Kangs Coomassie protokoll (A) utför starkt som silverfärgning enligt Shevchenko et al. (B) för att upptäcka proteiner efter 2-D gelelektrofores.

Del 4: Tips och tricks

• Utföra vissa tester stainings innan vi behandlar din egna prover. Av oförklarliga skäl rapporterade vi ibland att ett protein av intresse inte kunde upptäckas med framgång även när milligram tillämpades. I detta fall rekommenderar vi att förbereda några spädningsserie för att testa känslighet.
• Om du har låg-gel detektion av protein (er) i allmänhet, misslyckade överföring från stapling till separera gelen under SDS-PAGE kommer eventuellt vara orsaken. Du kan kontrollera för sådana klibbiga proteiner genom färgning hela gelen, inklusive stapling området.
• För en snabb verifiering av din isoelektrisk fokusering resultat kan du färga direkt IPG-remsor utan ytterligare andra dimensionen separation.
• Ibland vrider geler under färgningsproceduren så de är fläckade jämnt på båda sidor (om du håller geler oberörd, färgen bara binder till ena sidan av gelen).
• Vi upplevde att lagringen av färglösningen i en mörk flaska ökar dess livslängd (i genomskinliga flaskor upp till 4 månader).
• Efter färgning och dokumentera du kan hålla geler i kylen i flera år (om du lägger sur lösning du undvika föroreningar av svamp).
• Avfärgning av gel pluggar för en Tryptic smälta kan påskyndas genom uppvärmning i en motorvärmare.

Discussion

Innovativ eller bara en annan Coomassie protokoll?

Just nu finns det flera protokoll för färgning förfaranden Coomassie Brilliant Blue. De flesta av dem beror på mindre eller större ändringar av ett av de vanligaste protokollen som Neuhoff och kollegor ^2. Även Kangs protokoll baserat på Neuhoff formel. Men är det verkligen ett alternativ Coomassie färgning metod för proteomik forskning? Vi kommer bild två huvudfrågor, detektionsgräns och användbarhet, till bevis att det är definitivt en fördel färgningsprotokollet jämfört med andra Coomassie protokoll och även silver och fluorescerande stainings.

Fokus I: detektionsgräns

I Kang publikation upptäckte de flera markör proteiner upp till 1 ng / band (figur 2). Men enligt vår mening en detektionsgräns på 4-8 ng / bandet är mer sannolikt relaterade till praxis (tabell 1). De diskuterade vidare överlägsen känslighet nivåer i förhållande till såväl en kolloidal Coomassie protokoll med CBB G-250 i fosforsyra, ammoniumsulfat och metanol, och en sur silverfärgning (Silver Stain Plus Kit) från Amersham Pharmacia Biotechnology.

Figur 2: Representant SDS-gel publicerats av Kang et al. som visar kraften i den modifierade CBB-G250 protokollet. 250 ng / bandet proteiner lastades på de mest vänster och 2-faldigt utspädd till höger i följd.

Tabell 1: Färgning gränser för vanliga proteiner som tas från Kangs publicering i jämförelse med en mer realistisk gräns för protein detektion.

Protein	MW [kDa]	Protein belopp [ng] (virtuella kontra allvarliga)
myosin	220	1 / 4
b-galaktosidas	116	1 / 4
phosphorylase B	97	1 / 4
bovint serumalbumin	66	2 / 4
äggalbumin	45	4 / 8

För att bekräfta dessa detektionsgränser och för att ytterligare validera Kangs färgningsmetod vi utfört vårt eget testserie om gemensamma Laemmli SDS-gel med molekylvikt markörer upptäcks av kommersiellt tillgängliga fluorescerande infärgning lösningar som Sypro Ruby (BioRad) och Deep Purple (GE Healthcare) (Figur 3). Intressant, utför Kangs färgning poäng bra eller ännu bättre (i händelse av Deep Purple) och är därför definitivt överlägsen i termer av arbetsinsatser och prestanda!

Figur 3: Jämförelse av Kangs CBB-G250-baserade färgning (A) med Sypro Ruby (B) och Deep Purple (GE Healthcare) (figur 3). (C) färgning av protein band i SDS-PAGE. En molekylviktsmarkör innehåller phosphorylase b (97,4 kDa), BSA (66,2 kDa), äggalbumin (45 kDa), karbanhydras (31 kDa), sojabönor trypsin inhibitor (21,5 kDa) och lysozym (14,4 kDa) analyserades med protein uppgår 1 g / band på vänster sida av gelen och i följd efter utspädning 2-faldigt till höger.

Ändå var dessa detektionsgränser bestäms med standard proteiner som används för molekylvikt markörer och bör betraktas med försiktighet. Av denna anledning, testade vi dessutom Kangs färgningsmetod med olika proteiner som delvis har en svag affinitet till CBB (t.ex. fetuin, mycin). Som framgår i figur 4 är Kangs protokoll överlägsen den konventionella CBB färgning och även presterar bättre än Sypro Ruby, men kommer inte upp till silverfärgning i detta fall. Vi tror dock Kang ändrade färgning metod är ett utmärkt alternativ för känslig och snabb protein upptäckter i gel-baserad proteomik.

Figur 4: Protein färgning av fetuin med (A) Kangs kolloidal Coomassie protokollet (utan avfärgning) jämfört med (B) en konventionell CBB G-250 färgning (40% metanol och 10% ättiksyra), (C) Sypro Ryby och (D ) silverfärgning enligt Shevchenko et al. Protein mängder av 2 g spädas upp till 2 ng lastades för SDS-PAGE.

Fokus II: användbarhet
Förutom den förbättrade detektionsgränser inte erbjuda Kangs Coomassie protokoll flera funktioner som gör det förmånliga mot stainings av Neuhoff eller Candiano och även fluorescens protokoll:

• fastställande och färgning sker i ett steg
• inte mer än 4 steg i alla
• first färgningsresultat är snabba synliga (i de flesta fall inom mindre än 20 minuter)
• förfarande kräver endast 2 timmar för 80% slutförande av färgning
• baraminimal bakgrundsfärgning
• färgningsproceduren är mycket reproducerbara (det är en endpoint-metod)
• inga fler hantering med giftig alkohol (metanol ersätts med etanol)
• lösningen är nästan luktfri (ingen användning av ättiksyra)
• användning av CBB G-250 i låga koncentrationer.

Sammanfattningsvis är formeln ganska bekvämt, relativt ofarliga, miljövänligt och billigt. Dessutom Kangs färgning är helt kompatibelt med masspektrometri analyser. I slutändan kan man säga att Kangs Coomassie färgning är utmärkt för en snabb och analytisk i-gel detektering av proteiner även för proteomik strategier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Immobiline DryStrip gels	GE Healthcare	17-6001-94	Can even be used 2 years after expire date.
Immobiline DryStrip Reswelling Tray	GE Healthcare	80-6371-84	Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips.
Immobiline DryStrip Kit	GE Healthcare	18-1004-30	Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups.
EPS 3501 XL Power Supply	GE Healthcare	18-1130-05	Supplies voltage up to 3500 V.
Multiphor II Electrophoresis Unit	GE Healthcare	18-1018-06	Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips)
PerfectBlue gel system Twin S	Peqlab	45-1010-C	SDS-PAGE in 10x10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system.
staining dishes with lids	VWR international	216-3412	Fits for mini-gels. Stackable on shaker.
aluminium sulfate-18-hydrate	Merck & Co., Inc.	1.01102.5000	We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package.
orthophosphoric acid	Prolabo	20 624.295	Sold in glass bottles.