Konfokal Görüntüleme İzolasyon ve Yetişkin kardiyak miyositler Genetik Manipülasyon
Summary
Yetişkin, kardiyak miyositler hayvan kalpleri izole edilebilir ve birkaç gün kültüre temel hücrelerdir. Bu kültür süre içinde adenoviral gen transferi, genetik olarak kodlanmış biyosensörler (GEBs) ya da floresan füzyon proteinleri ifade etmek için kullanılır. Her iki yaklaşım konfokal mikroskobi ile hücresel soruşturma izin verir.
Abstract
Yetişkin kalpleri izole kardiyak miyositler, yaygın bir model bir yere, bir tarafta, embriyonik ve neonatal kas hücreleri ve diğer çalışan bir kalp arasındaki yarım olarak kabul edilir. Böylece, kardiyomiyositlerde kardiyak hücre fizyolojisi ve patofizyolojisi için iyi bir model olarak hizmet, ilaç gibi araştırmalar için transgenik hayvan modellerinde keşif için. Burada kalp hücreleri izole bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca kardiyak miyositler bir genetik manipülasyon transgenik hayvan yetiştiriciliği olmadan nasıl yapılabilir: Bu uzun vadeli bir kültür kombinasyonu (1 hafta) ve adenoviral gen transferi. Ikinci bir virüs inşaat hücrelerinin transdüksiyon açıklanmıştır. Bu ifade için genetik olarak kodlanmış biyosensörler (GEBs), floresan füzyon proteinleri kullanılır, ama aynı zamanda ifade üzerinde protein ve düzenleme, örneğin RNAi kullanarak aşağı olabilir. Burada bir füzyon proteinin hücre içi yapısı (Golgi) boyama ifade için bir örnek sağlar. Böyle bir protein ekspresyonu, hücre içi yapıların bir 3D-yeniden inşası için z yığınlarının konfokal görüntüleme ile görüntülenebilir. Protokol, hücre kültürü, moleküler biyoloji ve biyofizik state-of-the-art oluşur ve böylece hücresel kardiyoloji yeni ufuklar keşfetmek için bir yaklaşım sağlar.
Protocol
Discussion
Sıçan kardiyomiyositlerinin izolasyonu için açıklanan prosedür, gerekirse diğer türler, örneğin fare 4 adapte edilebilir. Uyarlanması gereken bir parametre sindirim için enzim karışımı (aşağıya bakın) ve aynı zamanda sindirim süresi. Bazı türler (örneğin fare) hücreler, diğerleri (örneğin, sıçan) daha kırılgan olabilir farkında olun.
Kollajenaz seçimi muhtemelen izolasyon prosedürü en önemli adımdır. Hemen hemen hiçbir partiden partiye var…
Acknowledgements
Bu çalışma, Alman Ulusal Bilim Vakfı (DFG) ve Federal Risk Değerlendirme Enstitüsü (BfR Almanya) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anesthesia solution | Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun) | Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 μl Rompun (2% Xylazinhydrochlorid) | ||
| Citrate solution | 117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution | |||
| Solution A | 134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Solution A+ | Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Liberase solution | F. Hoffmann‐ La Roche Ltd. | 11988476 001 | 500 μl stock solution in 15 ml solution A (stock solution: 10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.) | |
| Solution B | Content of solution A plus 200 μM CaCl2 and 0.1% DNase solution | |||
| Solution B1/2 | 1:1 mixture of solution A and solution B | |||
| DNase solution | Sigma‐ Aldrich Co. | D4527 | Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris‐HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol | |
| Extracellular matrix protein (ECM) solution | Extracellular matrix protein (ECM) solution | E1270 | 1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL medium M199 | |
| Culture medium M199 | PAA | E15‐834 | Medium M199 supplemented with 1 μl/ml ITS solution and 20 μl/ml penicillin‐streptomycin solution (5000 units/ml) | |
| ITS solution | 25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 μl Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear solution. Aliquots can be frozen. | |||
| Tyrode | 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Master mix | 5 μl 10×PCR‐Buffer, 5 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl forward primer, 2 μl reverse primer, 1 μl dNTP´s (10 mM each), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐DNA polymerase for each sample | |||
| LB‐Medium | 10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0 | |||
| Pac I | New England Biolabs | R0547L | preparation: 50 μg DNA, 5 μl 10×buffer, 0.5 μl 100×BSA, 0.75 μl Pac I, fill with H2O up to final volume of 50μl |
References
- Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, ., Licha, K., Lin, C. P. . Molecular Imaging II. Vol. 7370, 737008-737008 (2009).
- Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).
- Kaestner, L., Lipp, P., Shorte, S. L., Frischknecht, F. . Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 289-289 (2007).
- Kaestner, L., Lipp, P., Popp, J., von Bally, G. . Optics in Life Science. Vol. 6633, 66330K-66330K (2007).
- Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).
