Summary

Konfokal Görüntüleme İzolasyon ve Yetişkin kardiyak miyositler Genetik Manipülasyon

Published: September 17, 2009
doi:

Summary

Yetişkin, kardiyak miyositler hayvan kalpleri izole edilebilir ve birkaç gün kültüre temel hücrelerdir. Bu kültür süre içinde adenoviral gen transferi, genetik olarak kodlanmış biyosensörler (GEBs) ya da floresan füzyon proteinleri ifade etmek için kullanılır. Her iki yaklaşım konfokal mikroskobi ile hücresel soruşturma izin verir.

Abstract

Yetişkin kalpleri izole kardiyak miyositler, yaygın bir model bir yere, bir tarafta, embriyonik ve neonatal kas hücreleri ve diğer çalışan bir kalp arasındaki yarım olarak kabul edilir. Böylece, kardiyomiyositlerde kardiyak hücre fizyolojisi ve patofizyolojisi için iyi bir model olarak hizmet, ilaç gibi araştırmalar için transgenik hayvan modellerinde keşif için. Burada kalp hücreleri izole bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca kardiyak miyositler bir genetik manipülasyon transgenik hayvan yetiştiriciliği olmadan nasıl yapılabilir: Bu uzun vadeli bir kültür kombinasyonu (1 hafta) ve adenoviral gen transferi. Ikinci bir virüs inşaat hücrelerinin transdüksiyon açıklanmıştır. Bu ifade için genetik olarak kodlanmış biyosensörler (GEBs), floresan füzyon proteinleri kullanılır, ama aynı zamanda ifade üzerinde protein ve düzenleme, örneğin RNAi kullanarak aşağı olabilir. Burada bir füzyon proteinin hücre içi yapısı (Golgi) boyama ifade için bir örnek sağlar. Böyle bir protein ekspresyonu, hücre içi yapıların bir 3D-yeniden inşası için z yığınlarının konfokal görüntüleme ile görüntülenebilir. Protokol, hücre kültürü, moleküler biyoloji ve biyofizik state-of-the-art oluşur ve böylece hücresel kardiyoloji yeni ufuklar keşfetmek için bir yaklaşım sağlar.

Protocol

Dört önemli adımlar içeren protokol tüm tasarım üzerinde Şekil 1'de tasvir edilmiştir. Tüm adımlar tam ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Konfokal görüntüleme ile yaklaşık 24 saat takip Hücre izolasyonu, iletimi ve kültür, daha sonra üst üste ve zorunlu bir zaman çizelgesi. Virüs yapımı öncesinde hücre izolasyonu yapılmalı ve daha sonra genetik transdüksiyon için kullanılır. 1. Sıçan kalp yetişkin kardiyak miyositler izolasyonu Yetişki…

Discussion

Sıçan kardiyomiyositlerinin izolasyonu için açıklanan prosedür, gerekirse diğer türler, örneğin fare 4 adapte edilebilir. Uyarlanması gereken bir parametre sindirim için enzim karışımı (aşağıya bakın) ve aynı zamanda sindirim süresi. Bazı türler (örneğin fare) hücreler, diğerleri (örneğin, sıçan) daha kırılgan olabilir farkında olun.

Kollajenaz seçimi muhtemelen izolasyon prosedürü en önemli adımdır. Hemen hemen hiçbir partiden partiye var…

Acknowledgements

Bu çalışma, Alman Ulusal Bilim Vakfı (DFG) ve Federal Risk Değerlendirme Enstitüsü (BfR Almanya) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Anesthesia solution   Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun)   Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 μl Rompun (2% Xylazinhydrochlorid)
Citrate solution       117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution
Solution A       134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered
Solution A+       Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered
Liberase solution   F. Hoffmann‐ La Roche Ltd. 11988476 001 500 μl stock solution in 15 ml solution A (stock solution: 10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.)
Solution B       Content of solution A plus 200 μM CaCl2 and 0.1% DNase solution
Solution B1/2       1:1 mixture of solution A and solution B
DNase solution   Sigma‐ Aldrich Co. D4527 Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris‐HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol
Extracellular matrix protein (ECM) solution   Extracellular matrix protein (ECM) solution E1270 1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL medium M199
Culture medium M199   PAA E15‐834 Medium M199 supplemented with 1 μl/ml ITS solution and 20 μl/ml penicillin‐streptomycin solution (5000 units/ml)
ITS solution       25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 μl Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear solution. Aliquots can be frozen.
Tyrode       135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered
Master mix       5 μl 10×PCR‐Buffer, 5 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl forward primer, 2 μl reverse primer, 1 μl dNTP´s (10 mM each), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐DNA polymerase for each sample
LB‐Medium       10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0
Pac I   New England Biolabs R0547L preparation: 50 μg DNA, 5 μl 10×buffer, 0.5 μl 100×BSA, 0.75 μl Pac I, fill with H2O up to final volume of 50μl

References

  1. Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, ., Licha, K., Lin, C. P. . Molecular Imaging II. Vol. 7370, 737008-737008 (2009).
  2. Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).
  3. Kaestner, L., Lipp, P., Shorte, S. L., Frischknecht, F. . Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 289-289 (2007).
  4. Kaestner, L., Lipp, P., Popp, J., von Bally, G. . Optics in Life Science. Vol. 6633, 66330K-66330K (2007).
  5. Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).

Play Video

Cite This Article
Kaestner, L., Scholz, A., Hammer, K., Vecerdea, A., Ruppenthal, S., Lipp, P. Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (31), e1433, doi:10.3791/1433 (2009).

View Video