Summary
우리는 사후에 인간의 두뇌에있는 우수한 시간적 이랑의 레이어 III에서 단일 세포 인구, 피라미드 뉴런에서 RNA를 분리하고 추출 레이저 캡처 microdissection를 사용하여 프로세스를 설명합니다. 우리는 이후 선형 (T7 기준) mRNA를 증폭하고, Affymetrix microarray 인간 X3P에 샘플을 잡종.
Abstract
우리는 레이어 III의 피라미드 뉴런의 유전자 발현 프로필을 심문하여 정신 분열증 환자에서 볼 뛰어난 시간적 이랑에있는 회색 물질 감소를 조사하기 위해 제안. 그것은 잘 대뇌 피질은 다양한 지역, 레이어와 독특한 세포와 분자 작곡 따라서 차동 유전자 발현 프로파일이 특징입니다 각각의 세포 유형을 구성된 매우 이질적인 구조로되어 알려져있다. 조직 이질의 혼란함을 주죠 효과를 회피하기 위해, 우리는 특정 세포 유형 즉 피라미드 뉴런을 분리하기 위해 레이저 캡처 microdissection (LCM)을 사용합니다.
Histogene의 얼룩 솔루션 물들일 약 500 피라미드 뉴런은 아크 투 르스 XT LCM 시스템을 사용하여 점령했다. RNA는 다음 캡처 세포로부터 격리 및 아크 투 르스 / 분자 장치 키트를 사용하여 T7 기반 선형 증폭의 두 라운드를 받았습니다했다. Experion LabChip (바이오 래드) 겔과 electropherogram은 microarrays에 필요한 과거 600nt를 확장 성적표 길이와 양질에게 (M) RNA를 지적했다. 2.5 A260/280 비율에 의해 표시로 얻은 mRNA의 양은 허용 의미 샘플 순도와 51μg 평균. 유전자 발현은 Affymetrix의 GeneChip 인간 X3P 프로브 어레이를 사용하여 프로파일되었습니다.
Protocol
1) 조직 sectioning :
우리는 나이, 성별 및 사후 간격 (PMI) (표 1) 일치, 하버드 뇌 조직 리소스 센터에서 필요한 조직을 (제어 N = 9, 정신 분열증 N = 9) 취득. 액체 질소 증기 블록은 두께가 Brodmann의 영역 42 (우수한 시간적 이랑)에서 찍은 약 3mm했다.
피라미드 뉴런의 얼룩을 시작하기 전에 조건이 최적의 조직 '리프트'높은 RNA의 품질을 얻기 위해 최적화해야합니다. 조직 "리프트"는 캡쳐 표시된 뉴런은 뚜껑을 준수하고 나머지 조직이 남아있는 동안 분리 레이저 캡쳐 microdissection 동안 프로세스를 설명합니다.
최적화 :
- , RNA의 품질을 떨어뜨리고 RNase 활동을 감소 100 % 에탄올로 닦고 이외에 같은 RNase 써 같은 RNase의 오염 제거 솔루션 칼날과 슬라이드를 sectioning 작업 영역,,, 포함하여 모든 표면을 치료하기 위해.
- -17에서 설정 그라 이오 스탯과 함께 섹션 조직 ° C. 이것은 실온 (슬라이드), 그라 이오 스탯, 그리고 드라이 아이스 (아래 전체 프로세스 참조) 사이의 온도 기울기를 줄여줍니다. 온도가 -20 ° C 이하 경우, 조직 섹션들을 사용할 수 없게 렌더링, 조각하는 경향이있다. RNA의 무결성을 손상 수있는, 더 높이, 온도 기울기가 증가.
- 섹션 두꺼운 부분은 궁극적으로 조직 '리프트'을 타협하므로, 두께 8μm해야합니다. 이 두께는 캡쳐 피라미드 뉴런의 정확한 식별이 가능합니다.
- 레이저 캡처 과정에서 조직 "엘리베이터"방해하지 다음과 같이 일반 충전되지 않은 유리 슬라이드 (예 : Histogene LCM 슬라이드)를 사용합니다. 멤브레인 슬라이드도 사용하지만 멤브레인가이를 적외선 (IR) 레이저 스폿 크기를 증가 및 세포 특이성을 감소, 레이저 캡처 과정에서 약간 리프트 경향으로 이것은, 큰 조직 구조를 분리하기 위해 더 적합있을 수 있습니다.
- 슬라이드 당 두 개 이상의 섹션이 sectioning 과정에서 온도에 의한 지속적인 변화에 RNA의 품질을 손상시킬 수로, 유리 슬라이드마다 두 섹션을 탑재합니다.
- sectioning 후, RNA의 무결성을 유지하기 위해 드라이 아이스에 마이크로 슬라이드 상자에 즉시 슬라이드를 놓습니다. 처리 ° C까지 두뇌 섹션을 포함하는 슬라이드 상자 후 -80에 저장됩니다.
우리는 이전에 피라미드 뉴런에, 케이스 당 500 세포가 microarray의 하이브리드화 정도 RNA를 얻기 위해 충분한 것을 결정했습니다. 약 4 섹션은 주로 인해 유물 sectioning과 얼룩을, 케이스마다 필요합니다.
피라미드 뉴런 2) 스테 이닝 :
그것은 우리를함으로써 RNA를 보존, 수성 솔루션에 장시간 노출하지 않고 이러한 뉴런을 시각화 수로 피라미드 뉴런의 식별은, Histogene 빠른 얼룩 솔루션과 키트와 함께 이루어진다.
- RNase 활동을 제한하기 위해 얼룩 솔루션 (예 : Promega)를 100μl 당 1μl RNase 억제제를 추가하여 얼룩 절차 준비. 4 개의 섹션 (2 슬라이드), RNase 억제제 4μl 필요 1.5ml microcentrifuge 관 (얼음에 보관)에 Histogene의 얼룩 솔루션의 400μl에 추가됩니다. 각 섹션에 대한, 우리는 피라미드 뉴런을 확인하기 위해 우리에게 적절한 얼룩을 제공합니다이 솔루션의 97μl 사용합니다.
- Histogene 키트, 즉 2x75 % 95 %, 100 % 및 RNase없는 물 2 단지와 함께 제공되는 얼룩의 단지에 해당 ethanols의 나누어지는의 25ml : 탈수 시리즈 및 크실렌를 준비합니다. -20 ° C의 냉동고에이 놓으 75 % 병을 제외하고, 얼음 양동이의 모든 단지를 배치합니다. 퓸 배출 후드 아래, 조직 "엘리베이터"를 손상시킬 수 초과 물을 제거하기 위해 크실렌 항아리에 분자 sieves를 추가합니다.
- 42 설정 온도 waterbath (또는 열 블록)에 스위치 ° C와 waterbath의 랙 지원 50ml 팔콘 튜브를 놓습니다.
- -80 두 슬라이드를 제거 슬라이드의 모서리가 서리를 없애다 시작할 때까지 ° C와 서리를 없애다 그들 약 30 초 동안 KimWipe, 또는.
- 간단히 -20 ° C의 냉장고에서 30 초 동안 75 % 에탄올에있는 슬라이드를 수정. 오염을 줄이기 위해 RNase - 기절 집게를 사용하여 얼룩 개랑 사이에 슬라이드를 전송합니다.
- nuclease - 무료 물 속에 30초 세척 후, 섹션은 그러나 일반 유리 슬라이드로이 절대적으로 필요하지 않습니다, 솔루션에게 부분을 집중하기 위해 PAP 장벽의 펜으로 제시된 수 있습니다.
- 섹션 당 얼룩 / RNase 억제제 97μl와 함께 20 초 동안 Histogene의 얼룩 솔루션 네 개의 섹션을 얼룩. 그 후, 단계마다 30 초 동안, 얼음 이전에 준비 ethanols의 섹션을 탈수. 최종 100 % 에탄올 단계 3 분 연장해야, 적절한 조직 '리프트'에 대한 충분한 탈수를 달성하고 LCM 모자로 캡처하기 위해서 인치
- 캡처하기 전에 또 다른 5 분 펌 - 후드 5 분 공기 건조에 대한 크실렌에 슬라이드를 담가.
즉시 이후 레이저 캡쳐 경우 얼룩 단계는 수행하여야한다. 모든 솔루션은 오염을 방지하기 위해 적절한 탈수를 보장하기 위해 모든 4-6 슬라이드를 변경해야합니다.
3) 단일 셀 레이저 캡쳐 microdissection :
얼룩 후, 레이어 III의 피라미드 뉴런은 아크 투 르스 XT 시스템과 소프트웨어, 레이저 캡처 microdissection를 사용하여 제거됩니다. 간단히, 시스템이 직접 관심의 세포에 영화의 확장 / 팽만의 결과, 모자의 기지에 위치한 열가 소성 필름을 통해 조정 강도 IR 레이저를 pulsing으로 작동합니다. 뚜껑이 조직에서 해제되면, 세포는 모자를 캡처한 / 포로 남아 있습니다. 회화 요약 그림 1에 있습니다.
이 절차를 시작하기 전에, 그것은이 시스템을 사용할 수 뚜껑의 두 가지 유형 사이에서 구별하는 것이 중요합니다. 매크로 CapSure 뚜껑은 일반적으로 대규모 조직 구조를 캡처하는 데 사용됩니다 동안 CapSure HS 모자는 개별 세포의 작은 숫자를 캡처하도록 설계되었으며 따라서 이들 모자는 캡처를 위해 지정된 작은 표면적을 가지고있다. 매크로 캡하지 않지만 HS 모자 또한, 조직 섹션에 직접 접촉되지 않도록 뚜껑을 방지 레일 있습니다. 이 레일은 매크로 모자가 접혀, 고르지 않은 조직에 직접 앉아 같은 장소의 크기의 변화를 (레이저 펄스의)에 영향을 미치거나 질까 조직 접는의 효과를 줄일 수 있습니다. 우리의 절차는, 우리는 조직 접는의 효과를 줄이기 위해 자신의 능력을 활용하는 HS 뚜껑을 사용하지만, 우리는 세포의 많은 캡처 그대로 캡처 영역을 극대화하기 위해 소프트웨어에 매크로 캡 설정을 보관.
- 아크 투 르스 XT 장치에 슬라이드와 뚜껑을로드합니다. CapSure HS 모자를 사용하지만, 매크로에있는 프로그램 설정을 유지. 각 슬라이드의 개요 사진을 얻기 위해 상자 "개요 불러오기"를 클릭하십시오.
- 섹션 레이저 캡처에 대한 최적의 될 결정하기 위해, 배 확대에서 밝기 / 초점을 조정합니다. 과도한 접이식와 조직 섹션을 피할 수 있었 겠지만, 오히려 부드러운, 손상, 그리고 특히 관심 즉, 레이어 III의 지역 근처에 잘 스테인드 섹션을 선택합니다.
- 그러면 우리가 레이어 III를 포함해야하고, 캡처가 될 일반적인 지역에있는 모자를 넣으십시오. 아직 2 배 확대,이 뚜껑을 기울 있으므로 캡 레일은 어떤 주름에 휴식하지 않은지 확인하십시오.
- 다음, 우리는 40x 배율에서 수동으로 IR 레이저 스포트의 위치를 확인합니다. 그 자리 (적색 광선)는 블루 크로스와 연관되지 않으면, 이것은 그 자리에서 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 "있는 IR 장소"를 선택하여 조정할 수 있습니다.
- 40x에서, 우리는 다음과 같은 기준에 따라 피라미드 뉴런을 식별할 시작할 수 있습니다 (1) 피라미드 형태이며, (2) 꼭대기의 및 / 또는 기저 dendrites의 근위 부분 (그림 1A) 확인할 수있다 세포.
우리는 지금 피라미드 신경 세포를 캡처하기 위해 레이저 펄스의 파워와 기간을 조정합니다. 그것이 캡처 세포의 숫자 이외에 캡처한 세포의 특이성을 결정하는 등 이것은 특히 중요합니다. 맥박이 너무 약한 경우 맥박이 너무 강한 경우는 혼자 신경 세포 이외의 세포 / 세포를 둘러싼 캡처 수있는 동안 모든 식별 뉴런이 캡처됩니다. 일반적으로, 여기에 사용된 조직 및 세포 사양으로 약 피라미드 신경 세포의 크기에 맞춰 레이저 강도 (70mW)과 25μm의 스폿 크기 기간 (16msec) 결과, (그림의 1B). 그러나 이러한 설정은 사건 당 대략 같은 장소 크기를 얻기 위해 각 섹션을 세밀하게 조정됩니다. "승강기"가 손상되면, 하나는 항상 비교 각각의 경우에서 얻은 RNA의 양을 유지하기 위해 캡처 세포의 수를 늘릴 수 있습니다. 그러나, 1.5 시간에 따라 얼룩을 포함하여 캡처 시간을 유지하기 위해 이상과 같은 RNA의 품질을 손상 할 수 있어야합니다.
- 먼저 위치 기능에 더하기 기호를 클릭하여 뚜껑의 위치를 저장합니다. 어떠한 이유로든 우리가 뚜껑을 제거한 다음 같은 위치에 다시 배치해야해야하는 경우이 방법으로, 뚜껑은 항상 당신이 그 자리의 크기를 조정 것을 정확하게 같은 지점으로 돌아갑니다.
- 기간에 전원 및 16에 70 : 제어 상자에 해당 값을 입력합니다. Unclick는 "자동 이동 스테이지"옵션, 오른쪽 크기 기호 오른쪽에있는 패널에있는 기호와 연결합니다 있는지 확인합니다.
- 당신이 캡처를 테스트하고자하는 신경을 선택 서클 옵션 (오른쪽 아래)를 선택하고 다음을 클릭하여 레이저를 활성화"테스트 IR 장소"에.
- 레이저가 만들어내는 장소는 첫째로 캡처한 개체 주위에 선명 어두운 고리가 있어야합니다. 이 반지가 너무 밝은 경우, 세포가 캡처되지 않았습니다. 어둠 반지의 중간에 검은 얼룩이있다면, 레이저 강도 / 기간이 너무 높아, 그리고 그것은 캡처된 세포에서 RNA 선물에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 반지는 휴대폰을 비롯한 정도로 큰,하지만 원치 않는 조직이나 다른 세포를 포함하지 않는 정도로 작은 있는지 확인합니다.
- 현장 크기가 지역에 따라 차이가 없는지 확인하려면 캡처하고자하는 레이어 내의 조직의 다른 부분에 대한 과정을 반복합니다. 적절하게 조정합니다.
- 레이저 스폿이 조정되면 캡쳐 피라미드 뉴런을 확인하기 위해 계속합니다. 우리는 샘플마다 총 RNA의 약 500pg 결과 샘플 당 약 500 세포를 식별합니다. 우리는 또한 일반적으로 뚜껑 각 섹션에 대한 재조정되어야로서, 캡처 시간을 줄이기 위해 한 섹션을 사용합니다. 일단 당신이 필요로하는 모든 세포를 식별 레이저 캡처 버튼을 누르면 모든 세포가 자동으로 뚜껑 (그림 1C)에 캡처됩니다있다.
- 모든 세포가 붙잡힌 후, 섹션을 포함하지 않는 슬라이드의 다른 부분에 뚜껑을 이동합니다. 세포 캡처한 어디로 이동하여 뉴런의 최소 90 %가 제거되었습니다 있는지 확인하십시오. 그렇지 않을 경우, 동일한 세포를 탈환하려고하지만, 대부분의 세포가 포로로 붙잡혔습니다 지역을 찾아 같은 지역에서 더 많은 세포를 캡처하지 않습니다. QC 역에 뚜껑을 이동합니다.
- 추출 버퍼의 50ml (PicoPure RNA 격리 키트)를 포함하는 응용 Biosystems (cat. # N8010611)에서 0.5ml microcentrifuge 관에 뚜껑을 놓으십시오. 뚜껑은 누출에서 버퍼를 방지하기 위해 특정 튜브에 완벽하게 맞게 설계되었습니다.
- 추출 버퍼가 전체 뚜껑을 다루고 있는지 확인하고, 거꾸로 어셈블리를 켜고, 42에서 waterbath 세트에 이미 존재 50ml 팰컨 관의 하단 ° C.에 그것을 장소 뉴런은 뚜껑에서 조직을 제거하기 위해 30 분 incubated 수 있습니다.
- 이후, 800g에서 2 분 동안 튜브 및 캡 어셈블리를 원심 분리기. 뚜껑을 제거하고 -80에 남아있는 세포 추출물을 저장 ° C를 RNA 추출까지. 추가 예방 차원에서, 당신은 모든 뉴런은 뚜껑 자체에서 제거되었는지 확인하기 위해 레이저 캡처 장치에서 QC 역에 뚜껑을 다시 확인할 수 있습니다.
4) 특정의 연결 인구에서 RNA를 얻기 :
하나는 고립을 캡처에서 직접 이동하거나, -80 ° C 냉동고에 저장된 샘플을 해동 수 있습니다. 우리의 실험에서, 우리는 먼저 절연을 RNA로 진행하기 전에 -80에서 필요하고이를 저장된 모든 샘플 ° C를 수집.
RNA 분리는 LCM 샘플에서 세포의 작은 숫자를 분리하고 낮은 풍부한 mRNA를 유지하도록 설계되었습니다 PicoPure 절연 키트를 사용하여 수행됩니다. 일반적으로, 우리는 키트에 포함되어있는 프로토콜을 따르십시오. 아래, 우리는 프로세스의 기본적인 설명을 제공합니다.
- 해동 후, 열 필터로 RNA를 바인딩하기 위해 70 %의 에탄올 (키트와 함께 제공)과 미리 에어컨 정화 칼럼에서 원심 분리기를 추가합니다.
- 세척 후, DNA 간섭의 위험을 제거하기 위해 DNA의 완전한 제거를 보장하기 위해 DNase와 RNA를 취급. 이 단계는 실시간 qRT - PCR과 같은 다운 스트림 응용 프로그램에서 특히 중요합니다.
- DNA 소화에 따라 다른 세척 단계가 있습니다. 최종 샘플에있는 버퍼의 존재가 증폭을위한 RNA를 시작 적게 발생하므로 전혀 세척 버퍼가 다른 microcentrifuge 관에 전송하기 전에 열에 남아 없다는 것을 확인하십시오. 이것을 보장하기 위해, 우리는 제공된 프로토콜의 제안 2.5 분 대신에 2 분 동안 최종 세척 단계를 원심 분리기.
- 마지막으로, 용출 버퍼는 총 RNA를 elute하기 위해 원심 분리에 의해 다음 1 분 열에 추가 및 필터에 incubated입니다.
- 별도 0.5ml 튜브에 샘플을 각각의 피펫 1.3ul는 Experion HighSens LabChip을 실행합니다. -80에서 샘플의 나머지 부분을 고정 ° C.
RNA를 분리하면 품질 관리는 수량이 작고 특히, 매우 중요하다와 같은 microarray 실험 (15μg)에 필요한 금액은, 큰 것입니다. 추출한 RNA 따라서이 과정에 걸쳐 여러 시간 지점에서 품질 관리를 받아야합니다. 첫 번째는 추출 후 발생합니다. 우리는 electropherograms 및 Experion HighSens LabChip에 의해 생성된 가상 젤의 18S/28S 봉우리의 총 심사를 통해 총 RNA의 무결성을 설정합니다. 이 방법은 신속하고 RNA 품질 electropherogram와 가상 젤 (그림 2) 확인하는 측정의 두 방법을 제공합니다. 총 RNA의 품질 (그림 비교적 좋은 경우. 2A, B 대 C, D), 우리는 다음 선형 전체 RNA의 약 2 % 계정 mRNA를 증폭과 함께 진행합니다.
5) 선형 증폭 :
레이저 캡처 조직에서 추출한 RNA의 증폭은 이후 microarray의 하이브리드화 및 qRT - PCR 실험을위한 RNA의 충분한 양을 생산하기 위해 필요합니다. T7 기반 선형 증폭과 지적 잠재력 confounds의 가능성을 최소화하기 위해, 우리는 시작 레이저 캡처 조직 재료의 양을 극대화하여 필요한 증폭의 반올림의 수를 최소화.
우리 예비 데이터 (표시되지 않음) 약 500 세포를 포함하는 조직에서 추출한 총 RNA의 선형 증폭 (RiboAmp HS PLUS 키트)의 두 라운드가 아르나의 약 50μg 생산 것이 좋습니다 - microarray 및 qRT - PCR 모두의 성능에 대한 충분한 실험. 가능하다면, 열 자전거 타는 사람 및 키트에 제공된 0.5ml 튜브에 0.5ml 블록을 사용하여 0.2ml 및 0.5ml 튜브 사이에 시료의 불필요한 전송하지 마십시오.
다시 다음 프로토콜은 키트와 함께 제공되는 하나입니다. 간략 버전은 여기에 설명되어 있습니다.
- 총 RNA 샘플 (약 11μl)을 제공하는 프라이머의 1μl를 추가하고 65 품어 ° 4 놀아요 다음 5 분 C, ° C 1 분.
- 42 윗첨자 III 역방향 Transcriptase 및 부화 ° 1 시간 동안 C와 함께 첫번째 가닥 cDNA 구성 요소를 추가합니다.
- 둘째 가닥 cDNA 합성 후, 제공 정화 칼럼을 통해 결과 cDNA를 정화. 전송 후 튜브의 측면에 남아 최대 샘플 1μl에 대해서 한번 그 결과 해당 컬럼에 대한 샘플을 전송 후 - 여기 우리는 정화 열 샘플 플러스 바인딩 버퍼를 전송할 때, 두 번 샘플 튜브를 원심 분리기로하는 것이 좋습니다.
- 제공된 세척 버퍼로 cDNA를 씻고 용출 버퍼로 정화 cDNA를 elute.
- 시험 관내 전사 구성 요소에서 추가 42 6 시간 동안 품어 ° C.
- DNase 단계 후, 결국 용출 버퍼의 12μl의 총에서 eluting 제공된 버퍼와 결과 아르나 정화.
더 품질 관리 단계가 고용하는 후 - RNA가 (키트 프로토콜을 참조 별도 primers)를 선형 증폭의 또 다른 라운드를 겪습. 샘플 중 하나 UL은 약 StdSens LabChip (Experion)와 mRNA의 성적표 길이와 농도를 결정하는 250ng/ul로 희석합니다. 전통 Affymetrix microarray 기술은 mRNA가 검출하기 위해 길이는 적어도 600 세포핵해야합니다. LabChip에서 얻은 젤과 electropherogram 따라서이 최소 mRNA의 사본 길이 (그림 3) 묘사한다.
추가 품질 관리의 두 광학 밀도 즉, A260 및 A280 이루어진 비율은 RNA의 순도를 결정 NanoDrop 분광 광도계 분석을 통해 결정됩니다. 최대 2.7 비율이 비교 하이브리드화 품질을 가지고 표시되었습니다 비록 2.1 주변 광학 밀도와 샘플은 유전자 발현 분석을 위해 표시되어야합니다. 이것보다 낮은이 (심지어는 -80 ° C 이하의 온도에서) 저장 중에 저하를 RNA하게되었다 또한 가난한 microarray 결과를 주도하면서 집중력도 800ng/μl-1μg/μl 사이 여야합니다.
6) Affymetrix microarray 분석 비오틴 - 분류 mRNA 샘플 :
분자 장치에서 터보 비오틴 라벨 키트 (최종 라벨)이 증폭 샘플에서 얻은 아르나 레이블을하는 데 사용됩니다. 프로토콜의 단축 버전은 여기에 주어집니다.
- nuclease없는 물을 추가하거나 초기 농도에 따라 진공 원심 분리기에서 샘플을 집중하여 13μl 총 각 아르나 샘플 20 μg의 볼륨을 조정합니다. 단 15μg이 사용 Affymetrix의 칩에 필요한에도 불구하고 일부 RNA가 부화하고 원심 분리하는 동안 손실로, 우리는 초기 반응에 20μg을 추가합니다.
- 4 진정 후 30 분 85에서 비오틴 반응 ° C를 부화하고, ° C.
- 키트와 함께 제공되는 전문 칼럼과 원심 분리를 통해 초과 비오틴 레이블을 제거합니다. 어떤 경우에는, 특히 FFPE (포르말린 - 고정, 파라핀 - 임베디드) 시료에서 얻은 것과 저하 mRNA와 함께, 그게 아니라 모든 mRNA는 단일 원심 분리 단계에서 eluted되는 경우 수 있습니다. 그러면 일분의 후속 추가 원심 분리 단계와 그 결과 해당 컬럼에 대한 1 5μl 추가 nuclease 무료 물을 사이에 추가하는 것이 좋습니다. 이것은 표시된 샘플의 대부분 eluted 것을 보장합니다.
- 최종 볼륨 1μg/μl의 농도와 20μl입니다. 추가 nuclease - 무료 물을 추가한 경우에 샘플을 집중진공 원심 분리기와 올바른 볼륨. 우리는 이것보다 적게는 가난한 microarray 결과에 결과 저장 및 / 또는 하이브리드화하는 동안 저하로 이어질 것으로 나타났습니다 같은 800ng/μl 이상의 하이브리드화를 시작하기 전에 스토리지 농도를 유지하는 것이 좋습니다.
아르나는 다음 hybridized와 유전자 발현은 Affymetrix의 GeneChip 인간 X3P 프로브 어레이를 사용하여 프로파일되었습니다. 이 칩은 더 많은 저하 아르나위한되면서 우리가 제어 할 수없는 많은 요소가 사후 조직의 품질에 영향을 미칠 수 있으므로, 우리는주의로를 사용합니다. 저희 연구소가 하이브 리다이 제이션을위한 적절한 시설이 없었 때, 프로세스는 파트너 게놈 핵심 시설에서 수행되었다.
대표 결과 :
1 +2 +3) 조직은 피라미드 뉴런과 레이저 캡처 microdissection의 얼룩, sectioning :
위에서 설명한 프로토콜은 슬라이드 당 4 개의 섹션을 가진 두 개의 슬라이드를 초래한다. 각 섹션은 최소한이 균열 및 접이식, 찢어과 함께 부드럽게해야합니다. 올바른 얼룩으로 얼룩이 약 20 모호하게 스테인드 피라미드 뉴런을 식별할 수 - 피라미드 모양과 눈에 보이는 꼭대기의 dendrites과 크기 25μm. 섹션 / 총 RNA의 적어도 500pg의 결과로 사건 당 700 세포 - CapSure HS 매크로 설정에서 모자하고, 각 섹션에 대한 레이저 파워와 강도의 정확한 조정과 함께, 당신은 500 주위를 취득해야합니다. 약 85 - 뉴런의 100 %는 캡 (그림 1)을 준수합니다.
4) 특정의 연결 인구에서 RNA를 얻기 :
총 RNA 분리 후 설명한 바와 같이, 우리는 바이오 래드 Experion 통해 electropherogram 및 가상 젤 통해 RNA의 품질을 확인합니다. electropherogram에서는 18S와 28S ribosomal RNA 단위에 해당하는 두 개의 봉우리가 나타납니다. 조직 요인으로 인해 사전 sectioning을 저하 될 수 있으므로 사후 조직과 함께하지만, 이것은 항상 그렇지 않습니다. 당신은 일반적으로 18S 주위에 큰 피크, 그리고 작은 28S 피크 (그림 2A, B)와, 대형 범프 나타내는 저하를 볼 수 있습니다. 동안 electropherogram 프로필 샘플에 걸쳐 비교되면서, 우리는 모두 RT - PCR과 microarray 연구 (Imbeaud 외., 2005) 수행하기 위해 충분 mRNA 품질의 결과이 지침을 발견했다.
너무 저하가있는 경우 -로 electropherogram의 곡선 아래 넓은 지역으로 표시하거나, 봉우리가 표시되지 않은 경우 (그림 2C, D) - 세포는 조직에서 다시 캡처해야합니다. 우리는 또한 조직 블록 자체가 저하 여부를 확인하기 위해 세포를 recapturing 전에 RNA는 섹션 (아니라 세포)의 전체 조각에서 추출되는 조직 다쳤고, 테스트를,하고 권하고 싶습니다.
5) 선형 증폭 :
선형 증폭의 두 라운드 후 mRNA의 품질을 테스트하기 위해, 우리는 바이오 - 래드 Experion StdSens LabChip과 NanoDrop 분광 광도계 모두 사용했습니다. 전통 Affymetrix microarray 기술은 mRNA가이 프로토콜을 얻은 것입니다 감지하기 위해 길이가 적어도 600 세포핵 순서에 있어야합니다. 사실, mRNA의 길이는 1000 염기 범위로 검출되었다. electropherogram도 큰 봉우리가 서서히 시간 함수 (그림 3A, B)로 내림차순 이것을 반영합니다.
NanoDrop 판독이 가능한 mRNA (표 2)를 나타내는 샘플에 걸쳐 2.5 A260/A280 비율 평균을 지적했다.
우리의 결과는이 프로토콜과 함께 얻은 RNA의 수량과 품질 모두 Affymetrix GeneChip 인간 X3P를 통해 유전자 발현의 차이를 심문할 수있을만큼 좋은 것으로 나타났습니다.
6) Affymetrix microarray 분석 비오틴 - 분류 mRNA 샘플 :
Affymetrix GeneChip 인간 X3P으로 하이브리드화 후, 우리는 적절한 하이브 리다이 제이션 및 프로브 농도를 나타내는, 26.6 % (표 2)의 평균 퍼센트의 호출을 달성했습니다.
표 1 : 코호트 요약
| 샘플 | 그룹 | 성별 | 나이 | PMI |
| C1 | 제어 | F | 79 | 15.00 |
| C2 | 제어 | M | 22 | 21.47 |
| C4 | 제어 | M | 75 | 20.25 |
| C5 | 제어 | M | 80 | 15.50 |
| C6 | 제어 | F | 58 | 21.08 |
| C8 | 제어 | M | 61 | 17.00 |
| C10 | 제어 | F | 71 | 20.50 |
| C11 | 제어 | F | 12.66 | |
| C12 | 제어 | F | 86 | 6.92 |
| 뜻 | 4M/5F | 69.11 | 16.71 | |
| S1 | SCHIZOPH. | F | 93 | 6.92 |
| S2 | SCHIZOPH. | M | 55 | 21.40 |
| S3 | SCHIZOPH. | F | 67 | 21.80 |
| S4 | SCHIZOPH. | F | 55 | 22.00 |
| S5 | SCHIZOPH. | M | 36 | 17.97 |
| S6 | SCHIZOPH. | M | 62 | 10.75 |
| S8 | SCHIZOPH. | F | 92 | 17.80 |
| S11 | SCHIZOPH. | M | 56 | 21.83 |
| S12 | SCHIZOPH. | F | 88 | 13.33 |
| 뜻 | 4M/5F | 68.11 | 16.90 |
약어 : F - 여성, M - 남자, PMI - 사후 간격, schizoph. - 정신 분열증.
표 2 : 결과의 요약은 RNA 농도, 품질 및 하이브리드화 효율성을 묘사한
| 샘플 | [mRNA] NG / UL | A260/A280 | 프로브 강도 | 퍼센트 전화 |
| C1 | 1318.01 | 2.67 | 63 | 19.5 |
| C2 | 2312.93 | 2.37 | 147 | 30.6 |
| C4 | 1811.92 | 2.44 | 69 | 26.6 |
| C5 | 1316.26 | 2.51 | 78 | 34.7 |
| C6 | 1663.24 | 2.39 | 66 | 33.8 |
| C8 | 633.05 | 2.54 | 101 | 15.2 |
| C10 | 1326.4 | 2.47 | 92 | 32.5 |
| C11 | 994.24 | 2.75 | 76 | 22.4 |
| C12 | 817.23 | 2.7 | 56 | 15.2 |
| S1 | 2560.88 | 2.47 | 78 | 25.0 |
| S2 | 2169.61 | 2.43 | 76 | 26.5 |
| S3 | 2067.32 | 2.52 | 87 | 22.1 |
| S4 | 1563.89 | 2.75 | 82 | 28.1 |
| S5 | 2071.44 | 2.44 | 88 | 28.2 |
| S6 | 2532.59 | 2.34 | 72 | 30.7 |
| S8 | 2189.22 | 2.5 | 62 | 31.8 |
| S11 | 1669.89 | 2.47 | 41 | 27.3 |
| S12 | 1739.35 | 2.47 | 42 | 28.0 |
| 뜻 | 1708.75 | 2.51 | 76.44 | 26.57 |
그림 1 :. 레이저 캡처 microdissection 과정의 개요 A) 피라미드 뉴런은 morphologically 식별됩니다. 레이저는 열가 소성 필름을 통해 펄스 후에 B), 전지 뚜껑을 준수하고 뒤에 주변 조직을두고, 슬라이드에 따라서 더 이상 없습니다. C) 단일 세포 인구의 현미경은 레이저 캡처 후 CapSure 총액에 준수.
그림 2. 총 RNA 품질 관리 A + B C + D)이 총 RNA는 분리 후 모습을 보이고 있기 때문해야하는지 설명하는 동안), 절연 후 양질의 총 RNA를 나타냅니다. (B)에서 가상 젤과 함께 해당 명확 18/28S 봉우리와) electropherogram. C) electropherogram은 곡선 아래 넓은 지역을 보여주는없고 RNA 저하를 나타내는 더 18S/28S 봉우리. 이것은 또한 가상 젤 (D)로 표시됩니다.
그림 3 :. mRNA 품질 관리 A + B) Electropherogram (A) 및 가상 젤 (B)가 나타내는 mRNA 성적 증명서 렝microarray 연구에 필요한 일가 (확산), 즉 과거의 600 세포핵 (NT)를 확대. C + D) Electropherogram (C)와 mRNA의 성적표 길이 과거 200nt을 연장하지 않는, 같은 부족 mRNA의 확산이 모습이있는 것은 가상 젤 (D).
Discussion
여기, 우리는 아크 투 르스 XT 시스템과 관련 RNA 추출 키트를 사용하여 이기종 사후 뇌 조직에서 균일한 세포 집단을 추출하는 프로토콜을 사용자 정의하려고 시도합니다. 위에서 설명한대로, 우리는 RNA의 무결성을 극대화하기 위해, 회사가 제공하는 원래의 프로토콜에 몇 가지 수정을 만들었습니다. 단일 세포의 성공적인 촬영은 전적으로 좋은 RNA와 함께 최대의 세포를 달성하기 위해 캡처하기 전에 단계를 최적화에 따라 달라집니다. 이 단계에서는 조직 sectioning 및 얼룩과 관련된 다양한 매개 변수를 포함합니다. 즉, 조직의 준비에 대해서는 이러한은 다음과 같습니다 1), 2 sectioning 때 온도 기울기를 감소) 만 4, 얼음의 모든 탈수 단계를 수행 슬라이드 당 2 섹션 3) 배치) 증가) 얼룩, 5 RNase 억제제를 추가 삼분로 최종 100 % 에탄올의 탈수 기간.
안부가 캡처하기 위해, 우리는 매크로 설정에서 소프트웨어와 CapSure HS 모자,의 조합이 최적의 결과를 보장한다고 생각합니다. 높은 습도는 크게 조직 "엘리베이터"를 감소 등 습도 제어 환경, 캡처 한 세포에 중요합니다. 고온 또한 RNA의 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
PicoPure 키트와 RNA 격리 프로토콜 동안 두 세척 단계가 있습니다. 그것은 모든 씻어 버퍼가 RNA의 용출에 대한 다른 microcentrifuge 관에 전송하기 전에 제거 확인하는 최종 샘플에있는 버퍼의 존재로 증폭을위한 적은 시작 RNA가 발생합니다 중요합니다. 이것을 보장하기 위해, 우리는 제공된 프로토콜의 제안 2.5 분 대신에 2 분 동안 최종 세척 단계를 원심 분리기.
대부분의 경우, 선형 증폭 프로토콜은 제조 업체의 지시에 따라되었습니다. 이 프로토콜을 사용하면 단 두 개의 중요한 포인트를 고려해야한다 : 1) 튜브 사이의 온도 자전거 타는 사람에 0.5ml 블록과 함께 제공된에만 0.5ml 튜브를 사용하여 샘플을 초과하는 전송을 통해 RNA의 손실을 제한하려고 및 2) cDNA의 정화를위한 정화 열 샘플을 전송할 때, 첫 번째 전송 후 샘플 튜브를 스핀 다운해야합니다. 이것은 정화 열의에 추가하고 따라서 cDNA 복구를 향상시킬 수 있습니다 샘플의 추가 1 2ul집니다.
귀하의 제한 아르나 샘플 비오틴 - 라벨을위한 터보 최종 라벨링 키트를 이용하는 경우, 우리는 여분의 몇 μl를 추가하면 표시된 RNA가 열을 추출 수율 증가, 원심 분리 단계 전에 물을있어 좋습니다. 원심 분리의 추가 분 또한 같은 FFPE 조직과 같은 조직을 저하와 작업하는 특히,이 점에서 도움이 될 것입니다.
우리는이 프로토콜은 사용자가 이러한 불일치 사후 뇌 조직 내에 단세포 집단, 작은 균일한 구조를 분리 수 있도록 할 것이라 확신. 이 조사에서 특정 세포 유형으로 대상 결과로 이어지는 두뇌 내의 여러 레이어에 위치 주변의 구조와 다른 세포 타입의 희석 효과를 감소시킵니다. 결과 RNA의 품질이 microarray 연구에 대한 충분합니다, 우리는 질병 상태에 영향을 특정 세포 집단의 특정 분자 서명을 정확하게 시작할 수 있습니다.
Disclosures
이 비디오 문서의 생산은 생명 기술에 의해 후원되었다.
Acknowledgments
우리는 기꺼이 그 연구에 사용되는 시약 그들의 관대한 기부에 대한 분자 디바이스에게 분석 기술 / 아크 투 르스을 인정합니다. 우리는 또한 사후 인간 뇌 조직을 제공하는 하버드 조직 리소스 센터 감사 기금 :. RO1MH76060 및 P50MH080272.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4.5” Forceps | VWR international | 82027-392 | |
| Arcturus XT™ Laser-Capture Microdissection (LCM) System | MDS Analytical Technologies | 13821-00 | |
| CapSure™ HS LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0214 | |
| CapSure® Macro LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0211 | |
| Experion™ Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 700-7001 | |
| Experion™ RNA HighSens Chips | Bio-Rad | 700-7155 | 10 chips |
| Experion™ RNA HighSens Reagents | Bio-Rad | 700-7156 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Chips | Bio-Rad | 700-7153 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Reagents | Bio-Rad | 700-7154 | 10 chips |
| Falcon® polypropylene Conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| GeneAmp® thin-walled reaction tube with domed cap | Applied Biosystems | N8010611 | |
| GeneChip® Human X3P array | Affymetrix | 900516 | 6 chips |
| Histogene® LCM Frozen Section Staining kit | MDS Analytical Technologies | KIT0401 | For staining solution, jars, ethanols and Xylene |
| Histogene™ LCM slides | MDS Analytical Technologies | 12231-00 | |
| Micro Slide Box | VWR international | 48444-004 | |
| Microm HM 505E cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22-050-350 | Catalogue number for similar product as current product no longer available |
| Microprocessor Controlled 280 series Water bath | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 51221048 | Model 282 |
| Molecular Sieve | EMD Millipore | MX1583L-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | n/a | The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable. |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| PEN Membrane glass slides | MDS Analytical Technologies | LCM 0522 | |
| PicoPure® RNA Isolation kit | MDS Analytical Technologies | KIT0204 | |
| RiboAmp®HSPLUS with Biotin labeling | MDS Analytical Technologies | KIT0511B | 12 reactions Includes TURBO biotin labeling™ kit |
| RNase Zap® | Ambion | AM9780/2 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNasin® Plus | Promega Corp. | N261B | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 |
References
- Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 33, e56-e56 (2005).
