Summary
我们描述一个过程，利用激光捕获显微切割分离和提取RNA从一个同质的细胞群，锥体神经元，在上级死后人类大脑颞上回第三层。其后，我们线性放大（T7基于）的mRNA，Affymetrix公司人类X3P芯片杂交样品。
Abstract
我们提出要调查见于精神分裂症患者颞上回在灰质减少，通过询问在第三层锥体神经元的基因表达图谱。这是众所周知的，大脑皮层异常庞杂的结构，包括不同地区，层次和类型的细胞，每一个特点是由不同的细胞和分子组成，因此，基因差异表达谱。为了规避组织异质性的混杂的影响，我们用激光捕获显微切割（LCM），以隔离特定的细胞类型，即锥体神经元。
使用大角XT的LCM系统Histogene染色液染色约500锥体神经元被抓获。 RNA，然后从捕获的细胞中分离出，并经历了两轮基于T7使用大角/套分子器件的线性放大。的Experion LabChip（BIO - RAD）凝胶电泳表明，良好的质量（M）RNA，成绩单扩展微阵列所需的过去600nt的长度。获得表达量平均51μg可接受的平均样品纯度，A260/280比值为2.5，表示。异形使用基因芯片由Affymetrix公司的人力X3P探针阵列基因表达。
Protocol
1）组织切片：
我们从哈佛脑组织资源中心获得必要的组织（N = 9，精神分裂症N = 9），年龄，性别和死亡时间（PMI），（见表1）相匹配。液氮蒸汽块约3mm厚的布罗德曼面积42（颞）。
在开始锥体神经元染色之前，必须优化条件，以获得最佳组织“升降机”和RNA质量高。组织“升降机”，描述了在激光捕获显微切割的过程中，用于捕获标记的神经元坚持到第分开，而其余的组织留下。
优化：
- 为了减少RNase活性，影响了RNA的质量，对待所有表面，包括工作区，切片用核糖核酸酶净化解决方案的刀片和幻灯片，如核糖核酸ZAP除了用100％的乙醇擦拭，。
- 科的组织与低温恒温器设定在-17 ° C。这降低了室温（幻灯片），低温恒温器，和干冰（见下面的整个过程）之间的温度梯度。如果温度低于-20 ° C，组织切片切丝，使它们无法使用。较高，且温度梯度增大，这可能会危及RNA的完整性。
- 的部分应该是8微米厚，较厚的部分，最终将危及组织的“升降机”。这个厚度还可以捕获锥体神经元的正确识别。
- 使用普通不带电荷的玻璃，因为这些幻灯片（如Histogene LCM的幻灯片）不干扰组织在激光捕获过程中的“升降机”。也可用于膜的幻灯片，但这些都是更适合隔离大的组织结构，膜往往略有解除在激光捕获过程中，从而增加了红外线（IR）激光光斑大小，并降低细胞特异性。
- 装入两节每载玻片，超过部分每张幻灯片的温度可能会危及RNA的质量在切片过程中，由于不断变化。
- 切片后，立即放入微幻灯片中的幻灯片上干冰，以保持RNA的完整性。随后幻灯片箱的脑切片保存于-80℃直至处理。
我们先前已经决定，锥体神经元，500％的情况下细胞是否足够，以获得足够的RNA的基因芯片杂交。大约有四个部分每宗个案的需要，主要是由于切片和染色文物。
2）染色的锥体神经元：
锥体神经元的鉴定是取得Histogene快速染色液和试剂盒，因为它让我们这些神经元的可视化，不长时间暴露在水溶液中，从而保持RNA的。
- 准备加入每染色液100μL（如Promega公司）加入1μlRNase抑制剂以限制RNase活性染色过程。四节（2张幻灯片），要求4μlRNase抑制剂添加在1.5ml离心管放在冰上Histogene染色溶液400μl。对于每一个部分，我们使用这种解决方案，这给了我们足够的污渍确定锥体神经元97μl。
- 准备系列脱水和二甲苯：Histogene套件，即2x75％，95％，100％和2罐无RNase水提供的染色罐到相应的ethanols等分25毫升。所有罐子放置在一个冰桶，除75％的罐子，你在-20 ° C冰箱。根据通风柜，二甲苯JAR添加到分子筛除去多余的水分，这可能会危及组织的“升降机”。
- 水浴（或加热块）开关的温度设定为42℃，放置在机架水浴支持一个50毫升猎鹰管。
- 删除两个幻灯片，从-80 ° C和除霜他们在约30秒KimWipe，或直到幻灯片的角落开始解冻。
- 简单固定在75％的乙醇为30秒-20 ° C冰箱的幻灯片。染色采用RNase的手段传给钳，以减少污染罐之间传输的幻灯片。
- 在无核酸酶水冲洗30秒后，部分可能与PAP屏障笔概述，以便集中精力解决方案的部分，但是与普通的载玻片上，这是不是绝对必要的。
- 20秒Histogene染色液染色，四节，每节染色/ RNase抑制剂97μl。随后，脱水在先前准备好的冰ethanols部分，每步30秒。 100％的乙醇最后一步，应延长至3分钟为了达到足够组织的“升降机”足够的脱水和捕捉到LCM的上限。
- 在二甲苯中浸泡5分钟，在5分钟前捕捉油烟罩空气干燥幻灯片。
染色步骤应该只执行，如果激光捕获紧随其后。所有的解决方案应改为每4-6幻灯片，以防止污染，以确保适当的脱水。
3）单细胞激光捕获显微切割技术：
染色后，从第三层的锥体神经元是用激光捕获显微切割拆除，与大角XT系统和软件。简而言之，该系统通过一个可调节强度的红外激光脉冲，通过在第一个基地位于一个热塑性薄膜，造成直接到感兴趣的细胞在扩展/电影腹胀。当上限取消，是从组织细胞仍然帽上捕获/俘虏。图1给出了一个图案摘要。
在开始此过程之前，重要的是要区分两种类型的帽子与此系统。而宏观的CapSure上限一般是用来捕捉更大的组织结构，CapSure房协盖设计捕捉到单个细胞的小数字，因此这些上限为捕捉指定一个较小的表面积。协帽也有轨与组织切片的直接接触，防止帽，而宏观盖不。这些导轨减少纸巾折叠，可能会影响或诱导光斑大小的变化（激光脉冲），作为宏帽坐在折叠，组织不均匀直接的影响。我们的过程中，我们使用的HS盖到利用自己的能力，以减少纸巾折叠的效果优势，但保持软件宏的上限设置，以最大限度地捕获的区域，为我们捕捉大量的细胞。
- 负载上的大角星XT仪器的幻灯片和瓶盖。使用的CapSure HS帽，但保持宏观的程序设置。包装盒上的“概述负载”，获得每张幻灯片的概述照片。
- 调整亮度/焦距，放大2倍，以确定这节将激光捕获的最佳选择。组织切片，避免过多的折叠，而是选择部分都完好无损，表面光滑，以及染色，特别是附近地区的利益，即第三层，。
- 然后，我们一个上限，超过一般地区，我们将捕捉，确保包括第三层。仍然在放大2倍，确保第轨不休息任何褶皱，因为这将倾斜的第。
- 下一步，我们确认的红外激光光斑的位置，手动40倍的放大倍率。如果当场（红光）与蓝十字不相关，这可以调整，通过右击当场选择“位于红外点”。
- 40X，我们就可以开始（1）根据以下标准确定锥体神经元细胞，锥体的形状，（2）的根尖和/或基底树突近端部分识别（图1A）。
我们现在调整激光脉冲的功率和持续时间，以捕捉锥体神经元。这一点特别重要，因为它决定除了捕获细胞的数量捕获的细胞特异性。如果脉冲太弱，不是所有确定的神经元将被捕获，而如果脉冲是太强大了，它可以捕捉到周围组织/细胞，仅比神经元。一般来说，与这里的规范的组织和细胞，（70MW）的激光强度和持续时间（16msec）的25μm的光斑大小的结果，大约在锥体神经元的大小（图1B）。然而，这些设置进行微调，以每节，以获得大致相同的光斑大小每宗个案的。如果被攻破“升降机”，总是可以增加捕获细胞的数量，以保持RNA的量从每一种情况下获得媲美。但是，可以肯定的，让您的捕获时间，包括染色，1.5小时，比这更长的妥协RNA的质量。
- 先保存帽的位置，点击加号的位置功能。通过这种方式，如因任何理由，我们必须删除帽，然后需要把它在同一地点，帽将总是返回恰恰在同一地点，调整光斑大小。
- 这些值输入到控制箱为动力，到期限16：70。取消点选了“自动移动舞台”选项，并确保大小合适的符号的右侧面板上的符号的相关
- 选择圆的选项（右下）选择一个神经元，你想测试捕获，然后按一下激活激光“测试红外点”。
- 激光现货首先应该有一个清脆对象周围暗环抓获。如果这个环太亮，细胞是未捕获。如果在黑暗中环的中间有一个暗斑，然后激光强度/持续时间实在是太大了，和它可能有一个捕获细胞的RNA目前的负面影响。确保环大，足以涵盖的细胞，但足够小，它不包括不需要的组织或其他细胞。
- 层内，你想捕捉的过程，组织的不同部位，重复检查，当场大小不上的位置不同而异。相应的调整。
- 一旦激光点进行了调整，继续物色锥体神经元捕获。我们确定每个样品约500个细胞，结果在大约每个样本的总RNA 500pg。我们通常也只能使用一节为了减少捕获时间的金额，作为上限已经调整为每节。一旦你确定你需要的所有细胞，按激光捕获按钮，你的细胞会自动捕捉到帽（图1C）。
- 一旦所有的细胞已被抓获，将第一个幻灯片不包含一节的不同部分。返回到那里的细胞被抓获，并确保至少有90％的神经元被拆除。如果没有，不要试图夺回相同的细胞，但找到，其中大部分的细胞被抓获的区域，并在同一地区采集更多的细胞。移动到QC站的第。
- 放入含提取缓冲液50毫升（PicoPure RNA分离试剂盒）从美国应用生物系统公司（货号＃N8010611）0.5毫升的离心管中的第。上限已设计完美地融入这个特定的管，以防止泄漏的缓冲区。
- 倒转到大会，确保提取缓冲液覆盖整个第，并将其放置在底部50毫升猎鹰管在水浴中集已经存在42 ° C。为了消除来自该组织的第30分钟，培养的神经元。
- 此后，离心管800 克在2分钟和第大会。删除帽，并储存于-80 °，直到剩下的细胞提取物RNA提取彗星。作为一个额外的预防措施，你可以重新审视在QC站第激光捕获设备，以确保所有的神经元已删除从第本身。
4）从特定的神经元的人口获得的RNA：
人们可以直接捕获隔离，或解冻在-80 ° C冰箱中保存的样品。在我们的实验中，我们首先进行RNA分离之前收集所有需要存储他们的样品在-80 ° C。
使用PicoPure分离试剂盒，其目的是隔离LCM的样品细胞数量小，并保留低丰度mRNA的RNA分离。一般情况下，我们遵循的套件中包含的协议。下面，我们给出一个基本描述的过程。
- 解冻后，加70％乙醇（试剂盒提供）和空调预纯化柱离心，以绑定列过滤器的RNA。
- 洗涤后，治疗用DNase RNA的DNA，以确保彻底清除，以消除风险的DNA干扰。在下游应用，如实时定量RT - PCR，这一步就显得尤为重要。
- DNA的消化之后，还有另外一个清洗步骤。检查没有缓冲液洗依然在列，然后转移到另一离心管中，任何在您的最终样品的缓冲的存在将导致较少开始扩增的RNA。为了确保这一点，我们离心机为2.5分钟，而不是在所提供的协议建议的2分钟的最后一次洗涤步骤。
- 最后，洗脱缓冲液补充和培养过滤器在离心1分钟后列，以洗脱总RNA。
- 每个样本在不同的0.5毫升管移液器1.3ul运行的Experion HighSens LabChip。冻结其余样品在-80 ° C。
隔离的RNA时，质量控制是非常重要的，尤其是当数量小和所需金额，如微阵列实验（15μg），是大。提取的RNA，因此必须进行质量控制，在整个过程中的不同时间点。提取后的第一次出现。我们建立的总RNA的完整性，通过大体检查的电泳和凝胶的Experion HighSens LabChip虚拟18S/28S峰。这种方法快速，并提供了两种测量手段来检查RNA的质量电泳和一个虚拟的凝胶（图2）。如果总RNA的质量是比较好的（图。 2A，B对C，D），然后进行线性放大的mRNA，其中大约2％的总RNA。
5）线性放大：
激光捕获的组织中提取RNA扩增是必要的，以生产足够量的RNA随后芯片杂交和定量RT - PCR实验。为了尽量减少T7基于线性放大注意到潜在的混淆的可能性，我们最小化最大化出发组织材料激光捕获量，必要的轮扩增。
我们的（未显示）的初步数据表明，两轮包含大约500个细胞从组织中提取总RNA线性扩增（RiboAmp HS加套件）会产生约50μgARNA -足够的芯片和QRT - PCR的表现实验。如果可能，避免不必要的转移，在热循环仪和试剂盒提供的0.5毫升管的使用0.5毫升块样品之间0.2ml和0.5毫升管。
再次，该协议是用试剂盒提供的。这里描述的是一个缩略版。
- 添加提供的总RNA样品（约11μl）加入1μl引物和孵育65 ° C 5分钟，4心寒° C为1分钟。
- 第一链cDNA元件，连同标三反转录酶和孵化在42 ° C为1小时。
- 第二链cDNA合成后，通过提供一个净化柱净化造成的cDNA。在这里，我们建议将样品加结合缓冲液中纯化柱时，离心机的样品管两次 - 一次后，将样品列，作为样品加入1μl管双方仍然后转移。
- 洗的洗提供的缓冲区的cDNA，并与洗脱缓冲液洗脱纯化的cDNA。
- 添加在体外转录元件和6小时孵育42 ° C。
- 经过DNA酶步骤，净化与所提供的缓冲区导致ARNA，最终洗脱共洗脱缓冲液12μl。
的RNA进行另一轮的线性放大（单独的引物 - 见套件协议）后，雇用更多的质量控制步骤。一个UL的样品稀释约250ng/ul确定mRNA转录的长度和浓度与StdSens LabChip（的Experion）。传统Affymetrix公司的基因芯片技术要求的mRNA至少有600个核苷酸，才能被检测到。 LabChip获得凝胶电泳，因此描绘这个最小的mRNA转录的长度（图3）。
一个额外的质量控制是通过NanoDrop分光光度计分析，其中两个光密度，即A260和A280的比例，确定RNA的纯度决定。约2.1光密度的样品应标示基因表达分析，虽然以2.7的比率已被证明具有可比性的杂交质量。的浓度也应800ng/μl-1μg/μl之间，比这个低，导致RNA的降解，而在存储（即使在温度低于-80℃），也导致贫困的微阵列结果。
6）生物素标记的mRNA样品Affymetrix公司的基因芯片分析：
涡轮增压生物素标记试剂盒（末端标记）从分子器件是用来标记扩增产物得到的ARNA。这里给出一个缩短版的协议。
- 调整13μl总体积的20微克每ARNA样本加入无核酸酶水或集中在一个真空离心机的样品，根据初始浓度。即使只有15μgAffymetrix公司芯片是必要的，我们添加20μg的最初反应，一些RNA孵育和离心过程中丢失。
- 素在85 ° C反应，孵育30分钟，然后寒意在4 ° C。
- 通过与试剂盒中提供的专门列离心中取出多余的生物素标签。在某些情况下，特别是从FFPE（福尔马林固定，石蜡包埋）的样品中获得的，如退化的基因，它可能是，并不是所有的mRNA在单离心步洗脱的情况下。然后，我们建议增加1 -5μL额外的核酸自由水之间的列随后的1分钟的额外的离心步骤。这将确保标记的样本大部分是洗脱。
- 最终体积20μL的1μg/μl浓度。如果添加额外的核酸自由水，集中的样本真空离心机的正确的卷。我们建议保持之前存储的浓度超过800ng/μl开始杂交，我们发现，低于这一标准将导致在储存和/或杂交退化造成贫困芯片结果。
ARNA杂交和基因表达的异形X3P的人类基因芯片探针阵列，使用由Affymetrix公司。 ，由于这种芯片是为更多的退化ARNA设计的，我们使用它作为一项预防措施，因为我们无法控制的许多因素可以影响尸检组织的质量。由于我们的实验室没有足够的设施进行杂交，这一过程是在合作伙伴的基因组核心设施。
代表性的成果：
1 2 3）组织切片，染色锥体神经元和激光捕获显微切割：
上文所述的协议应在两个幻灯片，每张幻灯片四个部分结果。每个部分应以最小的撕裂，开裂和折叠顺利。有了正确的染色，污渍将确定深染的锥体神经元，约20 - 25微米的大小金字塔形状和可见的顶树突。 CapSure协宏设置上限，并正确调整的激光功率和每一节的实力，你应该得到大约500 - 700细胞每节/箱，造成至少500pg总RNA。约85 - 100％的神经元将坚持帽（图1）。
4）从特定的神经元的人口获得的RNA：
如上所述，总RNA的分离后，我们检查通过Bio - Rad公司的Experion虚拟凝胶电泳和RNA的质量。在电泳中，应该可以看到两个明显的峰值对应的18S和28S核糖体RNA的单位。尸检组织，但是，这并不总是如此，由于各种因素之前，以切片的组织可能会降低。通常你会看到一个大的凹凸表明退化，与周围18S的大高峰，和一个较小的28S峰值（图2A，B）。只要电泳型材在不同的样品相媲美，我们发现这一方针导致mRNA的质量不够好，执行RT - PCR技术和基因芯片研究（Imbeaud等，2005）。
如果有太多的退化 - 大面积下的电泳曲线表示，如果峰是不可见（图2C，D） - 细胞被捕获再次从组织。我们也建议做一个组织刮测试中，RNA是从整个片段的部分（不只是细胞）中提取，才夺回了的细胞，以确定是否组织块本身是退化。
5）线性放大：
为了测试后两轮线性扩增的mRNA的质量，我们在Bio - Rad的Experion StdSens LabChip和NanoDrop分光光度计的使用。传统Affymetrix公司的基因芯片技术要求的mRNA至少有600个核苷酸长度以被检测到，这是获得本议定书。事实上，基因长度检测到1000个核苷酸范围。该电泳与大峰慢慢降作为时间的函数（图3A，B），也反映了这一点。
NanoDrop读数显示整个样品A260/A280比值平均为2.5，说明可行的mRNA（见表2）。
我们的研究结果表明，与本议定书的数量和获得的RNA的质量是不够好，询问，通过Affymetrix公司人类X3P基因芯片基因表达的差异。
6）生物素标记的mRNA样品Affymetrix公司的基因芯片分析：
Affymetrix公司人类X3P基因芯片杂交后，我们取得了平均为26.6％（见表2）％的电话，表示足够的杂交和探针强度。
表1：队列摘要
| 样品 | 集团 | 性别 | 年龄 | 采购经理人指数 |
| C1 | 控制 | F | 79 | 15.00 |
| C2 | 控制 | 中号 | 22 | 21.47 |
| C4 | 控制 | 中号 | 75 | 20.25 |
| C5 | 控制 | 中号 | 80 | 15.50 |
| C6 | 控制 | F | 58 | 21.08 |
| C8 | 控制 | 中号 | 61 | 17.00 |
| C10 | 控制 | F | 71 | 20.50 |
| C11 | 控制 | F | 12.66 | |
| C12 | 控制 | F | 86 | 6.92 |
| 纬 | 4M/5F | 69.11 | 16.71 | |
| S1 | SCHIZOPH。 | F | 93 | 6.92 |
| S2 | SCHIZOPH。 | 中号 | 55 | 21.40 |
| S3 | SCHIZOPH。 | F | 67 | 21.80 |
| S4 | SCHIZOPH。 | F | 55 | 22.00 |
| 五 | SCHIZOPH。 | 中号 | 36 | 17.97 |
| 中六 | SCHIZOPH。 | 中号 | 62 | 10.75 |
| S8 | SCHIZOPH。 | F | 92 | 17.80 |
| S11 | SCHIZOPH。 | 中号 | 56 | 21.83 |
| S12 | SCHIZOPH。 | F | 88 | 13.33 |
| 纬 | 4M/5F | 68.11 | 16.90 |
缩写：F -女性，男-男，采购经理人指数-死亡时间，schizoph。 -精神分裂症。
表2：结果摘要描绘RNA的浓度，质量和杂交效率
| 样品 | [表达]吴/ UL | A260/A280 | 探头强度 | 百分比调用 |
| C1 | 1318.01 | 2.67 | 63 | 19.5 |
| C2 | 2312.93 | 2.37 | 147 | 30.6 |
| C4 | 1811.92 | 2.44 | 69 | 26.6 |
| C5 | 1316.26 | 2.51 | 78 | 34.7 |
| C6 | 1663.24 | 2.39 | 66 | 33.8 |
| C8 | 633.05 | 2.54 | 101 | 15.2 |
| C10 | 1326.4 | 2.47 | 92 | 32.5 |
| C11 | 994.24 | 2.75 | 76 | 22.4 |
| C12 | 817.23 | 2.7 | 56 | 15.2 |
| S1 | 2560.88 | 2.47 | 78 | 25.0 |
| S2 | 2169.61 | 2.43 | 76 | 26.5 |
| S3 | 2067.32 | 2.52 | 87 | 22.1 |
| S4 | 1563.89 | 2.75 | 82 | 28.1 |
| 五 | 2071.44 | 2.44 | 88 | 28.2 |
| 中六 | 2532.59 | 2.34 | 72 | 30.7 |
| S8 | 2189.22 | 2.5 | 62 | 31.8 |
| S11 | 1669.89 | 2.47 | 41 | 27.3 |
| S12 | 1739.35 | 2.47 | 42 | 28.0 |
| 纬 | 1708.75 | 2.51 | 76.44 | 26.57 |
图1：激光捕获显微切割过程的摘要 。）锥体神经元的形态是确定。 b）在激光脉冲通过热塑性塑料薄膜，细胞坚持帽，因此不再在幻灯片上，而使周围组织的背后。三）坚持到CapSure第一个同质化的细胞群的显微照片后，激光捕获。
图2：总RNA的质量控制 ，通过A + B）代表良好的质量总RNA后隔离，而C + D）说明了什么不应该总RNA后隔离。 a）在电泳与虚拟凝胶（二）有明确的相应18/28S峰。 c）在电泳显示曲线下大面积并没有说明RNA降解18S/28S峰。这也是在虚拟凝胶（四）所示。
图3：mRNA的质量控制。通过A + B）电泳（A）和虚拟凝胶（二）表明mRNA转录岭日（传播）芯片研究的必要，即延长过去的600个核苷酸（NT）。 C + D）电泳（C）和虚拟凝胶（四）显示什么不足的mRNA蔓延看起来一样，mRNA转录长度不延长过去200nt。
Discussion
在这里，我们尝试自定义协议的异构死后脑组织使用的大角星XT系统和相关的RNA提取试剂盒提取同质的细胞群。如上所述，我们已作了一些修改，由该公司提供的的原始协议，以最大限度地提高RNA的完整性。成功捕获单细胞完全取决于优化的步骤之前，捕捉，以达到最大细胞具有良好的RNA。这些步骤包括：与组织切片及染色相关的各种参数。总之，这些方面组织编制包括：1）降低温度梯度时切片，2）放置2节每张幻灯片，3）在冰上表演的所有脱水步骤，4）加入RNase抑制剂，污渍，5）在最后100％的乙醇至3分钟的脱水时间。
方面捕捉，我们认为结合CapSure HS帽与宏设置软件，应确保达到最佳的效果。湿度控制的环境中捕捉单个细胞的关键，在高湿度的大幅度降低组织的“电梯”。高温也可以对RNA质量的负面影响。
在与PicoPure套件的RNA分离协议中，有两个洗步骤。重要的是要检查所有的洗涤缓冲液，然后转移到另一微量RNA的洗脱管中删除，您的最终样品中存在的缓冲区的任何将导致开始在更短的RNA扩增。为了确保这一点，我们离心机为2.5分钟，而不是在所提供的协议建议的2分钟的最后一次洗涤步骤。
在大多数情况下，线性放大协议是根据制造商的指示。但是，有两个关键点，应考虑使用此协议时：1）尽量限制通过样品的过剩转移RNA的损失之间的管，只使用0.5毫升管结合提供了一个在热循环仪0.5毫升块; 2）当样品转移到纯化柱纯化的cDNA，请务必降速后的第一个转移的样品管。这将导致额外的1 - 2ul样品添加到纯化柱，因此可以增加的cDNA恢复。
当自己的有限ARNA样本的生物素标签的Turbo结束标记试剂盒的使用，我们建议增加一个额外的几微升的水的离心步骤之前，增加标记的RNA产量列中提取。一个额外的离心分钟，也将有助于在这方面，特别是如果你与退化的组织，如FFPE组织工作。
我们有信心，这个协议将使用户隔离单异质死后脑组织内的细胞群，如小的均质结构，。这样可以减少周围结构，位于大脑内的各层的其他细胞类型的稀释效应，导致对正在调查中特定的细胞类型有针对性的结果。由于所产生的RNA的质量是好的芯片研究不够，我们就可以开始针对特定的分子特征，特定的细胞在疾病状态影响的人口。
Disclosures
生产这种视频文章是由生命科技赞助。
Acknowledgments
我们非常感谢他们的研究中使用的试剂的慷慨捐赠分子器件分析技术/大角星。我们也感谢哈佛组织资源中心提供死后的人脑组织的资金来源：RO1MH76060和P50MH080272。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4.5” Forceps | VWR international | 82027-392 | |
| Arcturus XT™ Laser-Capture Microdissection (LCM) System | MDS Analytical Technologies | 13821-00 | |
| CapSure™ HS LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0214 | |
| CapSure® Macro LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0211 | |
| Experion™ Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 700-7001 | |
| Experion™ RNA HighSens Chips | Bio-Rad | 700-7155 | 10 chips |
| Experion™ RNA HighSens Reagents | Bio-Rad | 700-7156 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Chips | Bio-Rad | 700-7153 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Reagents | Bio-Rad | 700-7154 | 10 chips |
| Falcon® polypropylene Conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| GeneAmp® thin-walled reaction tube with domed cap | Applied Biosystems | N8010611 | |
| GeneChip® Human X3P array | Affymetrix | 900516 | 6 chips |
| Histogene® LCM Frozen Section Staining kit | MDS Analytical Technologies | KIT0401 | For staining solution, jars, ethanols and Xylene |
| Histogene™ LCM slides | MDS Analytical Technologies | 12231-00 | |
| Micro Slide Box | VWR international | 48444-004 | |
| Microm HM 505E cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22-050-350 | Catalogue number for similar product as current product no longer available |
| Microprocessor Controlled 280 series Water bath | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 51221048 | Model 282 |
| Molecular Sieve | EMD Millipore | MX1583L-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | n/a | The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable. |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| PEN Membrane glass slides | MDS Analytical Technologies | LCM 0522 | |
| PicoPure® RNA Isolation kit | MDS Analytical Technologies | KIT0204 | |
| RiboAmp®HSPLUS with Biotin labeling | MDS Analytical Technologies | KIT0511B | 12 reactions Includes TURBO biotin labeling™ kit |
| RNase Zap® | Ambion | AM9780/2 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNasin® Plus | Promega Corp. | N261B | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 |
References
- Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 33, e56-e56 (2005).
