Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantitativa Phosphoproteomics i Fatty Acid Stimulerade Saccharomyces cerevisiae Published: October 12, 2009 doi: 10.3791/1474
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Systems Biology

Summary

Beskrivning av en kvantitativ fosforylering förfarande med cryolysis, urea solubilziation, HILIC fraktionering och iMac anrikning av fosforylerade peptider.

Abstract

Detta protokoll beskriver tillväxt och stimulans, med fettsyror oleat av isotopiskt tunga och lätta S. cerevisiae celler. Celler mals med hjälp av en cryolysis förfarande i en boll kvarn kvarn och de resulterande grindate bringas i lösning genom att urea lösningsgörande. Detta förfarande gör det möjligt att lys av cellerna i ett metaboliskt inaktiva tillstånd, bevara fosforylering och förebygga omorientering av phosphoproteome under cellslys. Efter sönderdelning alkylering, trypsin nedbrytning av de proteiner, är proverna desalted på C18 kolonner och provet komplexiteten minskas genom fraktionering med hydrofil interaktion kromatografi (HILIC). HILIC kolumner behålla företrädesvis hydrofila molekyler som är väl lämpad för phosphoproteomics. Fosforyleras peptider brukar eluera senare i kromatografiska profil än den icke fosforyleras motsvarigheter. Efter fraktionering är phosphopeptides berikad med immobiliserade metall kromatografi, som bygger på laddning-baserade affinitet för phosphopeptide anrikning. I slutet av detta förfarande proverna är klara för kvantitativt analyseras med masspektrometri.

Protocol

Celltillväxt och media

  1. En enda koloni av BY4742Δarg4Δlys1 celler över natten i 100 ml rik media till en OD 600 på 1,0 så frön i två 1 liter kulturer en minimal jäst medelhög (0,17% Jäst Nitrogen Base utan ammoniumsulfat eller aminosyror, 0,5% ammoniumsulfat) som innehåller en full uppsättning av aminosyror, kompletterat med 20 mg / L isotopiskt normal eller tung arginin (13 C 6 15 N 4, Isotec) och lysin (13 C 6 15 N 2, Isotec).
  2. Cellerna odlades i 18 timmar, till en OD 600 på 1,8. Det är viktigt att cellerna gå igenom minst 9 generationer för att uppnå full integrering av den märkta isotoper. Ljuset provet var pelleterat, tvättas med sterilt vatten, reseeded till en oleate innehåller medium (isotopiskt vanligt arginin och lysin, 0,2% Oleate (Sigma kemikalier) och 0,5% Tween 40 (Sigma Chemicals)) och stimuleras ytterligare 85 minuter. Detta ger en isotopiskt ljus, med hänsyn till arginin och lysin, oleat-stimulerad prov och en isotopiskt tunga glukos-växt referensprov.

Cellslys, isolering och fraktionering av peptider

  1. Väg centrifugen flaska. Harvest prover genom centrifugering i 3 minuter. Ta bort media och aspirera överflödig vätska. Väg pellets och flaska (normalt avkastning mellan 1-2 gram) sedan blinka frysa i flytande kväve. Lägg till en volym som motsvarar pellets vikt "slipning" buffert för att de frusna pellets i flytande kväve (Fosfatbuffrad saltlösning (PBS, Gibco), 10% glycerol, proteashämmare (SigmaFAST Proteashämmare tabletter, Sigma) och stoppa fosfatas hämmare (Thermo Scientific )).
  2. Frysa slipning fartyget i flytande kväve. Vänta tills flytande kväve upphör kokning. Överför pellets till slipning fartyg med frysta kullager.
  3. Grind vid 600 rpm med ett 1 min 20 sek cykel med en inriktning vändning i 3 minuter. Frys slipningen fartyget i flytande kväve. Upprepa 4 gånger i 15 minuter totalt slipning tid.
  4. Samla frysta grindate till en 50 ml Falcon rör plats torris. Förvaras vid -80 ° C tills den ska användas.
  5. Gör en 10 ml lösning av 8M urea, 0,1 miljoner ammoniumbikarbonat, 0,1 miljoner Tris pH 8,6. Tillsätt 3 volymer av urea buffert till en volym av den frusna grindate (till exempel 3mls av urea buffert läggs till en 1 gram pellets med 1 ml PBS-buffert). Omedelbart Sonikera blandningen med en mätspets sonicator (2 - 10 sekunders pulser). Håll spetsen nära botten av röret för att förhindra skumning av lösningen. Den grindate bör omedelbart gå i lösning.
  6. Rensa lysat genom centrifugering i 5 minuter vid 4 ° C.
  7. Överför supernatanten till nya rör.
  8. Gör en ny delmängd av 0,5 tris [2-carboxyethyl] fosfin (TCEP). Lägg till provet vid 1:100 för en 5mm slutlig koncentration. Inkubera vid 37 ° C under 1 h.
  9. Alkylering av minskad cysteines. Låt svalna till rumstemperatur. Gör en ny delmängd av 1M iodoacetamide. Förvara i mörker (vi linda in röret i folie). Lägg till en slutlig koncentration av 20 mm. Inkubera i mörker i 1 timme i rumstemperatur.
  10. Släck den iodoacetamide med 20mm DTT från en 1M lager vid rumstemperatur under 1 h.
  11. Kvantifiera protein med en standard Bradford eller BCA analys (inte beskrivs). Ta ett prov för analys med SDS sidan nedan.
  12. För att validera införlivandet av tunga isotoper, användning 100 ìl av reducerade och alkylerad lysat. Späd 1:4 med dH 2 O, låt ligga och lägga till trypsin i 50:1 protein till trypsin. Digest i minst 4 timmar, torrt prov i en hastighet vac och sedan AVSALTA med en C18 Ultramicrospin kolumner (The Nest Group).
    1. Hydrate kolonnen med 100 l acetonitril
    2. Jämvikt med 200 l 0,1% TFA.
    3. Resuspendera torra provets 200 l 0,1% TFA. Laddar in i kolonnen. Centrifugera vid ~ 200 xg eller den minsta hastighet som krävs för att flödet genom kolonnen.
    4. Tvätta två gånger med 200 l 0,1% TFA.
    5. Eluera med två gånger med 50 l 60% acetonitril, 0,1% TFA.
    6. Torka provet i en hastighet VAC.
    7. Resuspendera provet i 20 l 0,1% myrsyra. Kör 2 l på en masspektrometer. Kontrollera inkorporering av isotopiskt tunga arginin och lysin av en 10 och 8 Dalton förskjutning i respektive m / z spektra. Införlivandet för varje aminosyra skall vara mellan 96 - 98%.
  13. Blanda motsvarande belopp (mg proteiner) av isotopiskt tunga och lätta prov.
  14. Späd provet 1:4 med 20% metanol.
  15. Lägg till trypsin på 1:200. Inkubera över natten vid 37 ° C.
  16. Kontrollera att matsmältningen har gått till färdigställande av SDS SIDA. Kör 2 och 4 ìl av predigestion provet och 8 end 16 l av posten trypsin smälta. Visualisera av Coomassie färgning att matsmältningen är klar. Om det inte är komplett, Sonikera provet med en mätspets sonicator kort och smälta igen med trypsin.
  17. Torka provet i en hastighet VAC. När torr tillsätt 200 l filtrerat dH 2 O och skaka tills pellets går i lösning. Torrt prov i en hastighet VAC. Resuspendera igen med dH 2 O. Torrt prov igen.
  18. Resuspendera pelleten i 0,1% Trifluoracetic Acid (TFA, Sigma). Kontrollera att pH är cirka 3 med hjälp av pH-remsor. Vid behov tillsätt 10% TFA.
  19. Pellets ut eventuell fällning.
  20. AVSALTA proverna på en Waters september-Pak Vac 500 mg C18 kolonn. Överbelasta inte dessa kolumner. Det maximala beloppet är 5 mg men det är bättre att ladda lite mindre. Dela upp provet mellan flera kolumner om det behövs.
    1. Hydrate kolonnen med 5 ml 100% acetonitril. Centrifugera vid ~ 200 xg eller den minsta hastighet som krävs för att flödet genom kolonnen.
    2. Jämvikt kolonnen med 5 ml 0,1% TFA. Ladda prov. Samla flöde och belastning igen.
    3. Tvätta med 5 ml 0,1% TFA. Upprepa.
    4. Eluera med 2 ml 60% acetonitril, 0,1% TFA.
    5. Torrt prov i en hastighet VAC.

Peptid Fraktionering och isolering av Phosphopeptides

  1. Peptider fraktionerade på en HILIC kolumn. Vi använder en Tosoh TSK-Gel amid-80 4,6 mm x 25 cm analytisk kolonn med ett skydd kolumn. Ta din tid med det här steget, kör kolumnen för 2 timmar vid 90% A sedan köra två tomma övertoningar innan du lägger ditt prov. Den maximala belastningen på en kolumn denna storlek är tänkt att vara cirka XX, vi brukar inte fylla på mer än 5 mg per körning.
  2. Lösningsmedel A - 98% ACN/0.1% TFA
    Lösningsmedel B - 2% ACN/0.1% TFA
    Belastning i 90% A över 20 ", 90% A till 85% A över 5, 85% A till 60% En över 40", 60% A till 0% A över 5, 0% A till 90% A över 5 ".
  3. Flödet är 1ml/min och fraktioner samlades in vid 2 minuters mellanrum med början vid 85% A till 60% en övertoning.
  4. Kombinera fraktioner för att minska antalet fraktioner till 10. Ökad fraktioner kommer troligen att ge större täckning av phosphoproteome.

Anrikning av phosphopeptides

  1. Phosphopeptides är berikad med fosfor Välj Iron Affinity Gel. Vi alikvot vår IMAC harts för att undvika upprepad frysning upptining. Gör 50 ml av en 250 mm ättiksyra, 30% ACN belastning lösning. Ta pH till 2,7 med HCl. Resuspendera pellets i 500 l av last lösning. Kontrollera pH, justera med HCl eller NaOH vid behov.
  2. Förtvätt 200 ìl IMAC pärlor i en lämplig kolumn. Vi använder Molbiotec spin kolumner.
    Tillsätt 15 l av en 50% uppslamning (gel att ladda lösning) för varje fraktion, och inkubera proverna för 30 "med överända rotation. Håll flödet för analys.
  3. Tvätta prover 3 gånger med last-lösning och en gång med 500 l filtrerad dH 2 O.
  4. Eluera peptider med 2 - 3 min med 400 l 50 mm Na 2 HPO 4 (pH 8,4) buffert. Överför till en injektionsflaska av glas.
  5. Surgör till pH 3 med 5 l 100% myrsyra, blixt frysa i flytande kväve och torkade provet i en hastighet VAC.
  6. Resuspendera phosphopeptides i 200 l på 0,1% TFA och C18 ren som beskrivits ovan. Torr ner elueras prover i en hastighet VAC.
  7. Resuspendera peptider i 20 l 0,1% myrsyra. Använd 2 l per masspektrometer analys eller efter behov.

Anteckningar

För mycket av detta protokoll kommer du att arbeta "blind". Den cellslys kan övervakas av Western blotting och Bradford eller BCA analyser och trypsin matsmältningen kan också lätt bedömas. Den HILIC kolumnen gav ett spår som liknar denna, eller som andra [1, 2] beroende på vätskekromatografi maskin som används. Prover övervakas av masspektrometri, testa dina prover på billiga maskiner såsom LCQs eller MALDIs innan du går till de höga kostnaderna analyser på en högmässa noggrannhet, hög upplösning maskin. Slutligen, om du en torkning ner ett prov med syra i den, använd glas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna metod kommer att ge en anrikning av phosphopeptides som kan kvantitativt analyseras. Ett antal parametrar kan ändras i detta protokoll, men det viktigaste att komma ihåg är att bevara din fosforylering. Beredning av celler för kvantifiering kan uppnås på flera olika sätt, till exempel om du inte kan märka dina celler in vivo, taggar såsom ICAT [3] eller ITRAC [4] kan användas efter utvinning till differentiellt etikett två kulturer för kvantifiering syften.

För fraktionering de vanligaste metoderna är gel fraktionering av SDS SIDA [5, 6], SCX kromatografi [7], och HILIC baserat kromatografi [1, 2]. Vi valde HILIC eftersom det behåller peptider till slutet av lutning, snarare eluerar på framsidan av lutning som i SCX men även andra grupper har haft god framgång med andra metoder.

När du använder IMAC du kan behöva öka eller minska mängden harts som används, tid för inkubation eller antal tvättar. Det har också förekommit studier som tittar på att ändra den inledande kemi av lasten lösning som vi presenterar här [8]. Denna kombination av metoder bör göra det möjligt isolering av prover som är mellan 60% till 95% phosphopeptides. När du väl har etablerat en metod för just ditt system bör du kunna optimera för högre avkastning på phosphopeptides.

Anrikning av phosphopeptides kan också uppnås med TiO 2 [9, 10] eller phosphoramidite kemi [11, 12] och studier har visat att varje metod kommer att ge överlappande men likväl skilda delar av phosphoproteome [13].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi vill tacka Dr Rich Rogers för tekniskt bistånd med masspektrometri analyser och hjälpsamma diskussioner, och Dr. Rob Moritz, Jeff Ranish och Hamid Mirzai för bra diskussioner.

Detta arbete har finansierats av NIH Centers of Excellence.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 Sigma-Aldrich 608033
Isotec™ L-Lysine-15N2 Sigma-Aldrich 609021
GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid Invitrogen 70011044
SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets Sigma-Aldrich S8820
Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific, Inc. 78420
Retsch PM100 Ball Mill Grinder Retsch 20.540.0001
Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar Retsch 01.462.0148
Ultramicrospin C18 column The Nest Group SUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18 Waters WAT043395
TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column Tosoh Corp. 13071 This is the HILIC chromatographic column.
Guard column 4.6 mm ID x1 cm Tosoh Corp. 19021 We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column.
PHOS-Select™ Iron Affinity Gel Sigma-Aldrich P9740 This is the IMAC resin. Aliquot and store.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Albuquerque, C. P. A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).
  2. McNulty, D. E., Annan, R. S. Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection. Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).
  3. Gygi, S. P. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).
  4. Ross, P. L. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  5. Gruhler, A. Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway. Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).
  6. Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of fission yeast. J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).
  7. Villen, J., Gygi, S. P. The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).
  8. Jensen, S. S., Larsen, M. R. Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques. Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).
  9. Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
  10. Pinkse, M. W. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).
  11. Tao, W. A. Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry. Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).
  12. Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation. Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).
  13. Bodenmiller, B. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).

Tags

Cellbiologi fosforylering Proteomics Cryolysis jäst HILIC iMac oleat SILAC
Kvantitativa Phosphoproteomics i Fatty Acid Stimulerade<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saleem, R. A., Aitchison, J. D.… More

Saleem, R. A., Aitchison, J. D. Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (32), e1474, doi:10.3791/1474 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter