Summary
マウスの新皮質に挿入直角microprismsは通常、スライスに見られる視点を持つ複数の皮質層の深いイメージングが可能になります。一ミリmicroprismsは、広い視野（〜900μm）と樹状突起棘を解決するために十分な空間解像度を提供します。我々はV層神経イメージングとmicroprismsを使用して新皮質の血管イメージングを示す。
Abstract
我々はマイクロプリズムの形状で深脳イメージングプローブを用いて皮質組織のin vivoイメージングのためのプロトコルを提示する。 Microprismsのサイズは1 mmのものであり、励起および発光光の内部反射を可能にするために斜辺上に反射コーティングを持っている。マイクロプリズムは通常、スライス標本に見られるような視点で同時に複数の皮質層の画像を調査。画像は、大視野（〜900μmの）で収集されます。さらに、我々は非生存外科手術と顕微鏡のセットアップに関する詳細を提供します。代表的な結果は、表面的な皮質層を貫通して延びると房に延び、その尖頭の樹状突起を示す汝- 1 YFP - HマウスからV層錐体ニューロンの画像が含まれています。分解能はV層のニューロンの細胞体の近くに画像の樹状突起棘に十分であった。蛍光色素の尾静脈注射は、皮質の血管の複雑なネットワークを明らかにする。毛細血管を流れる赤血球（RBC）のラインスキャンは、赤血球速度とフラックスレートが得られることを明らかにする。この小説マイクロプリズムのプローブは、深い細胞構造とin vivoでの皮質機能の可視化のエレガント、かつ強力な新しい方法です。
Protocol
パート1：マイクロプリズムの光学と顕微鏡のセットアップ
- 我々が使用するmicroprismsはOptosigmaコーポレーション（図1）から購入したBK7ガラス製の1mm、直角プリズムです。 Microprismsは、可能な限り鉗子を使用して処理されます。
- 2000nmの - マイクロプリズムの斜辺が400から97％以上の反射率を提供するために強化された銀で被覆されている。これはレーザーの励起光と放射される蛍光の両方の内部反射を提供します。
- Microprismsは常に、可能な場合は鉗子を使用して処理されます。手袋は、プリズムを清潔に保つために、常に着用している。
- 我々は、小動物のイメージングが可能なカスタムビルドの二光子顕微鏡を使用してください。定位装置に接続されている動物は、、3軸電動ステージ上に配置されています。
- 顕微鏡はscanimageソフトウェアを実行しているWindows PCに接続されています。 scanimageでもはPologrutoら1によってMATLABで書かれた画像取得ソフトです。
- マイクロプリズムのイメージングのために、我々は1024 × 1024または512 × 512ピクセルの解像度で画像を収集する。さらに、我々は通常、2ミリ秒/ラインまたは4ミリ秒/ラインでスキャン。
- 目標の2種類の実験に使用されています：
- 広い視野イメージングのための低開口数（NA）空気の目標（ 試薬および器具の表を参照）。
- 0で誘発される球面収差を最小限に抑えることのできるガラスの補正環を持つ高NAの空気の目標-ガラスの2mm（ 試薬および器具の表を参照）。
- 動物は、低倍率の目標の下でイメージングするための準備が完了すると、マイクロプリズムの上でレーザーの正方形のラスタスキャンパターンを合わせます。これは東洋のイメージを手助けし、レーザパワーの効率的な利用を行います。
- ガラスの補正環付き高NAの対物レンズを用いて、ガラスの約1mmを補正する補正環を設定します。蛍光画像は、実験中に表示されたら、人は慎重に画像の解像度を最大にするために補正環を最適化するために顕微鏡の内部に到達することができます。
パート2：非生存動物の手術とマイクロプリズムの挿入
- 手順全体の長さは、最初の切開からイメージングが完了するまで、実験の目的によって異なります。完了するまで40分 - しかし、非生存外科手術とマイクロプリズムの配置は、約30を取ることが期待できる。
- マウス（P30 - P60）が適切に外科的処置に適した平面にケタミン（100 mg / kg体重）及びキシラジン（10 mg / kg）のIP注入を用いて計量し、麻酔されています。
- 実験全体を通して、動物は麻酔のレベルを評価するために15〜20分間隔でチェックする必要があります。動物がしっかりつま先-ピンチに反応する場合、ケタミン/キシラジンの補足投与が必要です。一般的に補足用量は初回投与量の3分の1ですし、必要に応じて即座にIP注射用シリンジに事前に準備しておくことができる。
- マウスが適切に麻酔したら、動物の頭の毛の大部分は、第40刃とトリマーを使って剃っています。
- Nairさん®は、撮像中にマイクロプリズムの邪魔になることが毛髪の自由表面を作成するための頭の上に残っている毛に適用されます。 5分後、Nairさん®は綿棒を使用してオフに洗浄される。
- 麻酔動物を適切にマウスの定位装置に配置されます。外科的処置とイメージングのセッション中に動物は摂氏36度に設定された水を充填した加熱パッドに保持されます。
- 適切な場所に固定された動物の頭と、つのクリーンな切開は皮膚を分離するために頭蓋骨の内側行下にメスを用いて行われます。
- 3％の過酸化水素の少量綿棒に配置され、頭蓋骨と皮膚の間に膜を一掃するために頭蓋骨に適用されます。
- 過酸化水素はまたブレグマ、開頭を行い、マイクロプリズムを挿入する場所を知ることで主要なランドマークを明らかにすることができます。
- 開頭手術が開始される前に、耳のバーやかまバーは適切にそれが表で、基本的にレベルとなるように露出頭蓋骨を傾けるように調整されています。これは、開頭術のための優れたプラットフォームを提供します。さらに、これは入ってくる励起光をプリズムに直交の上面になります。これは撮影しながら光学収差を最小限に抑えることができます。
- 小さな歯のバリは（〜0.8 mmヘッドサイズ）フレキシブルエクステンションアームを使用してドレメル®ツールに接続されています。 craniotomiesの場合、我々は、約7,000〜10,000 rpmの速度を設定します。
- 正方形の溝が骨に確立されるまで、歯科用バーは、頭蓋骨に沿ってざっとれる。正方形の辺の長さは約2〜3 mmであると1.5mmの尾とブレグマへ横1 mmの中心。
- 小さな開口部が頭蓋骨を介して行われるまで、骨を薄く継続。鉗子CAのペアnは離れて頭蓋骨から骨弁を持ち上げる。
- 硬膜は、マイクロプリズムが皮質に挿入する前に削除する必要があります。出血は、最高の血液は、数分間表面に凝固させることによって制御されます。その後、凝固血液はマイクロプリズムを挿入する前に手術用スポンジを使用して削除されます。
- 皮質とプリズムの配置を支援する支援するために、マイクロプリズムの垂直面は、鉗子のハンドルと平行にラインアップしています。
- プリズムの上部は新皮質の表面と同一平面になるまで適切に開催されたプリズムと、全体のマイクロプリズムが挿入されます。
- 正しく挿入されると、マイクロプリズムは、適切な位置に残ります。ということに起因するいかなる出血は最小限で、小さな手術用スポンジで吸収することができる。プリズムが配置されると動物は、イメージングのための準備ができています。
- マイクロプリズムは動物で使用された後、それは何度も再使用することができます。しかし、それは適切に残っている生物学的物質を除去するクリーニングする必要がありません。これをメタノールに浸漬し、次に塩酸酸の小さなボリュームにプリズムを浸漬することによって行うことができます。洗浄マイクロプリズムは、将来の使用まで、レンズペーパーでラップできます。
パート3：代表的な結果
図1：右アングルマイクロプリズムの画像。この実験で使用したプリズムは、励起および発光光の内部反射を可能にするために斜辺上で強化された銀のコーティングとの間に1ミリメートル、BK7ガラスのプリズムです。
図2：レイヤーV YFP錐体細胞のイメージ。皮質表面から深さ900μmの - マイクロプリズム付きワイド視野イメージングは、錐体細胞体〜800の大規模な人口を明らかにする。さらに、層に向かって伸びる尖頭の樹状突起は、私も解決することができます。スケールバー= 200μmの。
図3：マイクロプリズムと組み合わせて使用するより高い開口数の目標は、V層錐体ニューロンで尖頭の樹状突起上の樹状突起を解決するために十分な空間分解能を提供します。スケールバー=10μmである。
図4：マイクロプリズムと蛍光色素の尾静脈注射を用いて得られた画像。画像は、皮質のボリュームを介して分岐深い脳の領域と小さな毛細血管から伸びる縦、大口径の血管を示しています。スケールバー= 200μmの。
図5：高開口数の対物レンズを用いて、新皮質の毛細血管のネットワークは、より詳細で画像化することができます。スケールバー= 50μmの。
図6：Microprismsはまた血管を流れるイメージング赤の血液細胞（赤血球）が可能になります。赤血球は蛍光色素を吸収しないため、容器全体の暗い縞と見られている。容器全体のラインスキャンによって、人はRBCフラックスと速度の測定値を得ることができます。スケールバー=10μmの（上部と下部の画像で水平バー）と250ミリ（下の画像の縦棒）。
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Discussion
イメージングの実験ではマイクロプリズムを使用しては比較的簡単ですし、新皮質上でin vivo試験のための多くの利点を提供しています。このテクニックを使用する代表的な例としては、V層の皮質ニューロンにおける黄色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスから撮影した画像が含まれています。 microprismsを使用して、一つはV層、皮質表面の下に約1 mmの大錐体細胞体のコレクションを見ることができます。また見タフツ（図2）に分岐する前に、すべての浅層を通って延びる尖頭の樹状突起があります。これらの実験に使用したマウスは、V層のニューロン（YFP - H 2）にYFPを発現するように設計されたトランスジェニック動物である。これらのYFP - Hマウスとガラスの補正環付き高開口数の対物レンズを用いて、それはイメージより詳細に樹状突起をすることも可能ですし、樹状突起棘（図3）を解決する。
一つは、また、確立された尾静脈注射の技術を使用して、このようなフルオレセインデキストランのような蛍光色素で皮質血管にラベルを付けることができます。一般的に、成体マウスのために生理食塩水で20 mg / mlの時フルオレセインデキストラン100μlのボーラス注入が適切です。マイクロプリズムは新皮質（ステップ2.16の後）に挿入された後に最良の結果は、色素を注入することから来る。このテクニックを使用して一つの深い層からの大きな口径の血管がPIA向かって延びるとmicrocapillaries（図4）のネットワークを形成する分岐見ることができます。新皮質のmicrocapillariesのこの複雑なネットワークは、最高の高開口数対物レンズ（図5）を用いて評価されています。
さらに、それは容器（図6、トップ画像の赤線）の長さに沿ってラインスキャンによる深い新皮質の毛細血管から赤血球速度とフラックスを測定することが可能です。赤血球は蛍光色素を占有しないので、彼らは暗い縞として表示されます。ラインスキャンからの結果は、1つの軸と他の軸（図6、一番下の画像）の時間次元の空間次元を持っている。画像これらの画像から、1つは毛細血管を通じて赤血球のフラックスと速度を計算することができます。図6の場合には、RBCのフラックスは36赤血球0.45ミリメートル/秒の速度で/秒と測定された。これは、文献3の結果と一致している。
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Disclosures
動物実験はエール大学のIACUCによって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。
Acknowledgments
我々は、YFPマウスを提供するためのアンソニーJ. Koleske、博士に感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| With enhanced silver reflective coating-(R77) | OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA) | 055-0010 | With enhanced silver reflective coating-(R77) |
| Fluorescein-dextran | Sigma-Aldrich | FD70 | 70 kDa |
| 0.28 NA, 4x air objective | Olympus Corporation | XLFLUOR 4x/340 | |
| 0.60 NA, 40x air objective | Olympus Corporation | LUCPLFLN | With 0-2 mm coverglass correction |
References
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).
