Summary
直角microprisms允许插入到小鼠大脑皮层多个皮质层的深成像与通常在切片中发现了一个观点。一毫米microprisms提供了一个广阔的领域的视图（〜900微米）和空间分辨率足以解决树突棘。我们证明V层神经成像和新皮层的血管成像，使用microprisms。
Abstract
我们现在活体成像的皮层组织，使用了深刻的脑成像探头在一个微形的协议。 Microprisms 1毫米大小，有一个斜边的反射涂层，让内部的激发和发射光的反射。微探针同时图像多个角度皮质层通常仅见于片的筹备工作。图片是一个大型的收集领域的视图（〜900微米）。此外，我们提供了生存的非外科手术的细节和显微镜设置。代表性的结果，包括从你的YFP - H - 1小鼠显示他们的顶树突延长通过表面的皮质层，并延伸到塔夫茨V层锥体神经元的图像。决议足以形象V层神经元的胞体附近的树突棘。一个荧光染料的尾静脉注射，揭示了在皮层血管的复杂网络。流经毛细血管的红细胞（红血球）线扫描揭示RBC速度和通量率可以得到。这种新颖的微探针是一个优雅的，但功能强大的可视化深层细胞的结构和在体内的皮质功能的新方法。
Protocol
第1部分：微光学显微镜设置
- 我们使用的microprisms 1毫米，直角棱镜，从Optosigma公司（图1）购买的BK7玻璃制成的。 Microprisms处理尽可能使用镊子。
- 斜边的微涂有增强银提供大于97％的反射率从400 - 2000纳米。这提供了内部反射的激光激发光下发出荧光。
- Microprisms总是在可能时使用产钳处理。手套戴在任何时候都保持棱镜清洁。
- 我们使用一个定制的双光子显微镜的小动物成像能力。动物，立体设备，被放置在一个3轴机动阶段。
- 该显微镜是连接到Windows PC运行ScanImage软件。 ScanImage是图像采集软件在Matlab的书面Pologruto 等 1 。
- 微成像，我们收集分辨率1024 × 1024或512 x 512像素的图像。此外，我们通常在2毫秒/线或4毫秒/线扫描。
- 实验中使用两种类型的目标是：
- 较低的数值孔径（NA）为宽视场的视图成像空中目标（ 见试剂和仪器表） 。
- NA与玻璃能够最大限度地减少由0引起的球面像差校正领一个更高的空中目标- 2毫米的玻璃（见试剂和仪器表）。
- 当动物准备一个低倍率目标下成像，对准激光与微顶部的方形光栅扫描模式。这将有助于东方的形象和激光功率的使用效率。
- 使用玻璃校正领一个更高的NA目标，设置校正领正确的约1毫米的玻璃。一旦在实验过程中出现了荧光图像，可以仔细显微镜内达到优化的校正领，以最大限度地提高成像分辨率。
第2部分：非生存的动物手术和微插入
- 整个过程的长度，从最初的切口，直至完成成像，取决于实验的目标。然而，可以预料，非生存的外科手术和微安置约30 - 40分钟才能完成。
- 小鼠（P30 - P60），称重，麻醉，适当使用注射氯胺酮（100毫克/公斤）和甲苯噻嗪（10毫克/公斤）的IP适合外科手术的一个平面。
- 在整个实验中，动物应检查每次15-20分钟，以评估其麻醉水平。如果动物的反应，一个坚定的脚趾捏，氯胺酮/甲苯噻嗪的补充剂量是必需的。通常情况下，补充的剂量初始剂量的三分之一，并可以立即腹腔注射的注射器提前做好准备，如果需要的话。
- 一旦鼠标是适当的麻醉，大多数动物的头的头发剃掉使用＃40刀片的微调。
- 奈尔®应用到余下的头发在头上，以帮助创建一个表面的头发可能在成像方式的微。 5分钟后，奈尔®是使用棉签拭子清除。
- 麻醉的动物是正确放入鼠标立体设备。动物的外科手术和成像会议期间保持在一个充满水的加热垫设置在36摄氏度。
- 妥善固定在动物的头，一个干净的切口，使用下来的头骨内侧线手术刀分开皮肤。
- 小金额的3％的双氧水是放在一个棉签拭子和应用扫清之间的头骨和皮肤膜的头骨。
- 过氧化氢也有助于揭示前囟，知道从何处执行的开颅手术，插入微的一个重要里程碑。
- 开颅手术开始前，耳酒吧和咬栏适当的调整，倾斜等，它基本上是与表级暴露颅骨。这提供了一个更好的平台，为开颅。此外，这使得传入激发光垂直棱镜的顶面。这将有助于最大限度地减少光学像差，同时成像。
- 一个小的牙科毛刺（〜0.8毫米头的大小）是连接到一个DREMEL ®工具，使用一个灵活的延伸臂。 craniotomies，我们设置了约7000至10000 rpm的速度。
- 牙科毛刺脱脂沿着头骨，直到建立一个方形的凹槽是在骨。广场两侧约2-3毫米，长度为中心的1.5毫米的尾鳍和1毫米，横向到前囟。
- 持续变薄，直到一个小口是通过颅骨骨。一对钳CAñ解除远离颅骨骨瓣。
- 硬脑膜可分为皮质中的微前需要删除。最好控制出血，让血液凝固几分钟表面。随后，凝固的血是使用手术前插入微海绵删除。
- 为了帮助协助与皮质棱镜的对齐方式，垂直的微面是一字排开平行镊子处理。
- 有了正确举行棱镜，整个微棱镜顶部插入，直到与新皮层的表面平齐。
- 正确插入时，微应保持在适当的位置。任何出血，结果是最小的，可以用一个小的手术海绵吸收。一旦棱镜动物成像准备。
- 微已经在动物使用后，它可以多次使用。但是，它需要得到适当的清洗，以消除任何剩余的生物材料。这可以通过一个由浸成甲醇，盐酸的体积小，浸入棱镜。清洗微然后可以在镜头纸包裹，直到将来使用。
第3部分：代表结果
图1：正确的角度微的图像。本实验所用的棱镜是一毫米，BK7玻璃棱镜加强斜边允许内部的激发和发射光的反射银涂层。
图2：V层YFP的锥体神经元的图像。宽视场的成像与微显示一个人口大锥体细胞体〜800 - 900微米深的皮质表面。此外，扩大对层的顶树突我也可以得到解决。比例尺= 200微米。
图3：提供足够的空间分辨率来解决V层锥体神经元顶树突树突棘与微一起使用的一个更高的数值孔径目标。比例尺= 10微米。
图4：使用微尾静脉注射和荧光染料得到的图像。图像显示垂直，大口径的船只从脑深部地区和分支通过皮质体积较小的毛细血管延伸。比例尺= 200微米。
图5：使用较高的数值孔径目标，新皮层中的毛细血管网络，可以更详细的影像。比例尺= 50微米。
图6：Microprisms也允许成像红血细胞（红细胞）通过船只流动。不吸收荧光染料的红细胞，因此作为整个船只的暗条纹。整个船只的线扫描，可以得到红细胞的流量和速度的测量。比例尺= 10微米（在顶部和底部的形象单杠），250毫秒（在底部图像竖线）。
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Discussion
使用微成像实验相对来说比较简单，在大脑皮层的体内研究提供了许多优点。使用这种技术的有代表性的例子包括在V层皮层神经元的表达黄色荧光蛋白的转基因小鼠拍摄的图像。使用microprisms，人们可以看到一个大V层的锥体细胞机构的收集，近1毫米以下皮质表面。也看到了延长塔夫茨大学（图2）前分歧，通过所有的表面层的顶树突。用于这些实验的老鼠是转基因动物表达YFP的，只有在V层神经元（YFP - H 2 ）。使用这些YFP - H的小鼠和玻璃校正领了更高的数值孔径的目标也是可能的形象更详细的树突和解决树突棘（图3）。
人们也可以标签皮质血管荧光葡聚糖建立尾静脉注射技术，如荧光染料。通常情况下，成年小鼠100 UL在20毫克/毫升生理盐水注射荧光素葡聚糖丸是适当的。最好的结果来自注射染料后的微已经插入到新大脑皮层（步后2.16）。使用这种技术，人们可以看到从深层大口径船只对PIA延伸和分支形成microcapillaries网络（图4）。这microcapillaries在新皮层的复杂网络是最好的赞赏使用高数值孔径物镜（图5）。
此外，它是可能的线扫描测量红细胞的速度和通量深新皮层毛细血管沿长度的船只（图6，在最上面的图片红线）。由于红细胞不占用荧光染料，它们将出现暗条纹。图片，从一个线扫描结果有一个轴的空间维度和时间维度在其他轴（图6，底部图像）。从这些图像，就可以计算出红细胞通过毛细血管的流量和速度。在图6的情况下，红细胞通量测量36个红细胞/秒，0.45毫米/秒的速度。这是从文献3的结果达成协议。
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Disclosures
动物实验是由美国耶鲁大学的IACUC规定的准则和法规的规定执行。
Acknowledgments
我们感谢安东尼J. Koleske，博士提供YFP的小鼠。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| With enhanced silver reflective coating-(R77) | OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA) | 055-0010 | With enhanced silver reflective coating-(R77) |
| Fluorescein-dextran | Sigma-Aldrich | FD70 | 70 kDa |
| 0.28 NA, 4x air objective | Olympus Corporation | XLFLUOR 4x/340 | |
| 0.60 NA, 40x air objective | Olympus Corporation | LUCPLFLN | With 0-2 mm coverglass correction |
References
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).
