Summary
الحق الزاوية microprisms إدراجها في القشرة المخية الحديثة الماوس يسمح للتصوير عميق للطبقات قشرية متعددة مع وجهة النظر التي توجد عادة في شريحة. واحد ملليمتر microprisms العرض حقل من رأي واسعة (900 ميكرون ~) والقرارات المكانية كافية لحل شجيري العمود الفقري. نظهر طبقة V التصوير العصبية والأوعية الدموية التصوير باستخدام microprisms القشرة المخية الحديثة.
Abstract
نقدم لبروتوكول في مجال التصوير من الأنسجة الحية القشرية باستخدام مسبار التصوير في أعماق المخ في شكل microprism. Microprisms هي 1 ملم في الحجم ولها طلاء عاكسة على وتر للسماح التأمل الداخلي من الإثارة والخفيفة الانبعاثات. التحقيق microprism الصور في وقت واحد طبقات قشرية متعددة مع منظور ينظر عادة إلا في شريحة الاستعدادات. يتم جمع الصور مع حقل كبير من رأي (~ 900 ميكرون). بالإضافة إلى ذلك ، ونحن نقدم تفاصيل بشأن الإجراء غير الجراحي والإعداد بقاء المجهر. النتائج ممثل تضمين الصور طبقة من الخلايا العصبية الهرمية الخامس من خاصتك - 1 - H YFP الفئران تبين التشعبات التي تمتد من خلال قمية طبقة قشرية سطحية وتمتد إلى خصلات. وكان القرار كافية لصورة العمود الفقري شجيري قرب سوما طبقة من الخلايا العصبية الخامس. إن الحقن الذيل الوريد صبغة الفلورسنت يكشف عن شبكة معقدة من الأوعية الدموية في القشرة. خط المسح الضوئي لخلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) التي تتدفق من خلال الشعيرات الدموية RBC يكشف سرعة ويمكن الحصول على معدلات التدفق. هذا التحقيق microprism الرواية أنيقة ، طريقة جديدة لكنها قوية من تصور الهياكل الخلوية العميق وظيفة القشرية في الجسم الحي.
Protocol
الجزء 1 : بصريات والإعداد Microprism مجهر
- وmicroprisms التي نستخدمها هي 1 ملم ، والحق الزاوية الموشورات مصنوعة من الزجاج BK7 شراؤها من شركة Optosigma (الشكل 1). يتم التعامل مع Microprisms باستخدام الملقط كلما أمكن ذلك.
- غير المغلفة ووتر من microprism بالفضة المعززة لتوفير انعكاسية أكبر من 97 ٪ 4-200 نانومتر. يوفر هذا التأمل الداخلي من كل من ضوء الليزر الإثارة ومضان المنبعثة.
- يتم معالجتها باستخدام الملقط Microprisms دائما عندما يكون ذلك ممكنا. يتم ارتداء القفازات في جميع الأوقات للحفاظ على المنشور نظيفة.
- نستخدم مبنية خصيصا اثنين الفوتون المجهر قادرة على تصوير الحيوانات الصغيرة. يوضع الحيوان ، والتي تعلق على الجهاز المجسم ، في مرحلة من 3 محاور بمحركات.
- توصيل جهاز كمبيوتر المجهر لتشغيل ويندوز ScanImage البرمجيات. ScanImage هي الصورة البرمجيات اقتناء كتب في Matlab بواسطة Pologruto آخرون 1.
- microprism للتصوير ، نقوم بجمع الصور في القرار 1024 x 1024 بكسل أو 512 512 س. بالإضافة إلى ذلك ، فإننا عادة تفحص في 2 مللي / سطر أو 4 مللي ثانية / السطر.
- يتم استخدام نوعين من الأهداف في التجارب :
- وأقل موضوعية الفتحة العددية الهواء (NA) للتصوير الميداني للرؤية واسعة (انظر الجدول من الكواشف والمعدات).
- A الهواء العالي NA الهدف مع كوب طوق تصحيح قادرة على الحد من الانحرافات الناجمة عن كروية 0-2 ملم من الزجاج (انظر الجدول من الكواشف والمعدات).
- عند الحيوان هو على استعداد للتصوير تحت الهدف التكبير منخفضة ، محاذاة نمط النقطية مربع مسح الليزر مع الجزء العلوي من microprism. وهذا سيساعد على توجيه الصورة وجعل الاستخدام الكفء للطاقة الليزر.
- الهدف باستخدام أعلى NA مع كوب طوق التصحيح ، تعيين ذوي الياقات تصحيح لتصحيح ما يقرب من 1 ملم من الزجاج. مرة واحدة في صورة الفلورسنت يظهر أثناء التجربة ، يمكن للمرء أن يصل بعناية داخل المجهر لتحسين طوق تصحيح لتعظيم قرار التصوير.
الجزء 2 : عدم بقاء جراحة الحيوان والإدراج Microprism
- طول الإجراء بأكمله ، من شق مبدئي لحين الانتهاء من التصوير ، ويعتمد على أهداف التجربة. ومع ذلك ، يمكن توقع موضع غير البقاء على قيد الحياة العملية الجراحية وmicroprism لاتخاذ ما يقرب من 30 -- 40 دقيقة لإكمالها.
- يتم وزن الفئران (P30 - P60) وتخدير مناسب باستخدام حقنة IP الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) إلى طائرة مناسبة لعمليات جراحية.
- في كافة مراحل التجربة برمتها ، يجب فحص الحيوان كل 15-20 دقيقة لتقييم مستواه من التخدير. إذا كان هذا الحيوان هو مطلوب يتفاعل مع شركة أخمص القدمين ، قرصة ، وجرعة إضافية من الكيتامين / زيلازين. عادة جرعة إضافية من ثلث الجرعة الأولي ، ويمكن أن تكون على استعداد في وقت مبكر في محقنة للحقن IP فوري إذا لزم الأمر.
- مرة واحدة على الماوس تخدير بشكل صحيح ، حلق الأغلبية من الشعر على رأس الحيوان قبالة باستخدام الانتهازي بشفرة # 40.
- يتم تطبيق ® ناير إلى الشعر المتبقية على رأسه للمساعدة على خلق سطح خال من الشعر التي قد تحصل في الطريق من خلال microprism التصوير. بعد 5 دقائق ، ويتم تنظيف ® ناير قبالة باستخدام مسحة القطن ذات الرؤوس.
- وضعت بشكل صحيح في تخدير الحيوانات ماوس الجهاز المجسم. أثناء العمليات الجراحية وجلسات التصوير يبقى الحيوان على المياه المليئة سادة التدفئة وضعت في 36 درجة مئوية.
- مع رأس الحيوان ثابتة في مكانها الصحيح ، يتم شق واحد نظيف باستخدام مشرط أسفل خط وسطي من الجمجمة لفصل الجلد.
- يتم وضع كمية صغيرة من بيروكسيد الهيدروجين 3 ٪ على مسحة القطن ذات الرؤوس وتطبيقها على الجمجمة لازالة الأغشية بين الجمجمة والجلد.
- بيروكسيد الهيدروجين يساعد أيضا على الكشف عن bregma ، معلما رئيسيا في معرفة مكان لأداء حج القحف وإدراج microprism.
- قبل بدء حج القحف ، تعدل بشكل صحيح أشرطة الأذن وشريط لدغة لإمالة الجمجمة يتعرض مثل هذا فإنه من مستوى أساسا مع الجدول. وهذا يوفر أفضل منصة لحج القحف. بالإضافة إلى ذلك ، وهذا يجعل السطح العلوي للعمودي المنشور مع ضوء الإثارة واردة. وهذا سيساعد على تقليل الانحرافات البصرية في حين التصوير.
- تم توصيل لدغ صغيرة الأسنان (~ 0،8 ملم حجم الرأس) إلى أداة ® DREMEL باستخدام ذراع تمديد مرنة. لcraniotomies ، وضعنا السرعة إلى حوالي 7000 إلى 10،000 RPMS.
- غير منزوع الدسم ولدغ الأسنان على طول الجمجمة حتى يتم تأسيس أخدود مربع في العظام. جوانب مربع تقريبا 2-3 ملم في الطول ، وتركزت الذيلية 1.5 مم و 1 مم الجانبي لbregma.
- استمرار ترقق العظم حتى يتم من خلال فتحة صغيرة في الجمجمة. زوج من كاليفورنيا ملقطن رفع رفرف بعيدا عن العظام في الجمجمة.
- والجافية يحتاج إلى إزالتها قبل أن يمكن إدراج microprism في القشرة. يتم التحكم أفضل نزيف الدم عن طريق السماح للتخثر على السطح لعدة دقائق. بعد ذلك ، تتم إزالة دم متخثر باستخدام اسفنجة جراحية قبل إدراج microprism.
- للمساعدة على مساعدة في محاذاة المنشور مع القشرة ، واصطف الوجه العمودي للmicroprism حتى موازية لالمقابض على ملقط.
- مع المنشور الذي عقد بشكل صحيح ، يتم إدراج microprism كامل حتى في أعلى المنشور هو مطاردة مع سطح القشرة المخية الحديثة.
- عندما أدرجت بشكل صحيح ، يجب أن تبقى في microprism الموقف السليم. أي أن النتائج النزيف هو الحد الأدنى ويمكن استيعابها مع الاسفنج جراحية صغيرة. مرة واحدة المنشور في مكان الحيوان مستعدة للتصوير.
- بعد أن تم استخدام microprism في حيوان ، فإنه يمكن إعادة استخدامها مرات عدة. ومع ذلك ، فإنه يجب أن يتم تنظيفها بشكل صحيح لإزالة أي مواد المتبقية البيولوجية. ويمكن تحقيق ذلك من خلال غمس المنشور في حجم صغير من حمض الهيدروكلوريك ، يليه تراجع الى الميثانول. يمكن تنظيفها ثم microprism تكون ملفوفة في ورقة عدسة حتى استخدامها في المستقبل.
الجزء 3 : النتائج الممثل
الشكل 1 : صور من microprism حق الزاوية. المناشير المستخدمة في هذه التجربة هي واحدة عادية مواشير الزجاج BK7 مع طلاء الفضة المعزز على وتر للسماح التأمل الداخلي من الإثارة والخفيفة الانبعاثات.
الشكل 2 : صورة V طبقة الخلايا العصبية الهرمية YFP. مجال واسع للرؤية التصوير مع microprism يكشف عن عدد كبير من أجسام الخلايا الهرمية ~ 800-900 ميكرون عميقة من سطح القشرية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن التشعبات قمية تمتد نحو طبقة أنا أيضا أن تحل. مقياس بار = 200 ميكرومتر.
الرقم 3 : الهدف فتحة أعلى العددية المستخدمة في بالاشتراك مع microprism يوفر القرار المكانية كافية لحل العمود الفقري شجيري على التشعبات قمية على الخلايا العصبية طبقة هرمية V. مقياس بار = 10 ميكرومتر.
الشكل 4 : الحصول على صورة باستخدام microprism وحقن الوريد الذيل صبغة الفلورسنت. صورة تظهر العمودي والسفن ذات عيار كبير يمتد من مناطق الدماغ العميق والشعيرات الدموية الصغيرة قبالة المتفرعة من خلال حجم القشرية. مقياس بار = 200 ميكرومتر.
الشكل 5 : استخدام أعلى هدفا الفتحة العددية ، يمكن تصويرها على شبكة من الشعيرات الدموية في اللحاء الجديد بمزيد من التفصيل. مقياس بار = 50 ميكرومتر.
الشكل 6 : Microprisms كما يسمح لخلايا الدم الحمراء والتصوير (كرات الدم الحمراء) التي تتدفق من خلال السفن. كرات الدم الحمراء لا تمتص صبغة الفلورسنت ، وبالتالي فهي تعتبر الظلام المشارب في جميع أنحاء السفينة. عن طريق المسح الضوئي عبر الإنترنت السفينة ، يمكن للمرء الحصول على قياسات تدفق RBC والسرعة. مقياس بار = 10 ميكرومتر (شريط أفقي في أعلى وأسفل الصورة) و 250 مللي ثانية (شريط عمودي في الصورة السفلى).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باستخدام microprism في تجربة التصوير واضح ومباشر نسبيا وتوفر العديد من المزايا لفي الدراسات المجراة على القشرة المخية الحديثة. أمثلة ممثل باستخدام هذه التقنية تشمل الصور المأخوذة من الفئران المعدلة وراثيا التعبير عن بروتين فلوري الصفراء في الخلايا العصبية الخامس طبقة قشرية. باستخدام microprisms يمكن للمرء أن يرى مجموعة كبيرة من الهيئات الخلايا الهرمية في الطبقة الخامسة ، ما يقرب من 1 ملم تحت سطح القشرية. ينظر أيضا هي قمية التشعبات التي تمتد عبر كل الطبقات السطحية قبل متباينة في خصلات (الشكل 2). الفئران المستخدمة في هذه التجارب هي حيوانات معدلة وراثيا تهدف إلى التعبير عن YFP فقط في طبقة الخلايا العصبية الخامس (YFP - H 2). باستخدام هذه الفئران YFP - H والتعليم العالي هدفا الفتحة العددية مع كوب طوق تصحيح فمن الممكن أيضا أن صورة مع التشعبات بمزيد من التفصيل والعمود الفقري لحل شجيري (الشكل 3).
ويمكن تسمية واحدة أيضا في الأوعية الدموية القشرية مع صبغة الفلورسنت مثل فلوريسئين - ديكستران أنشئت باستخدام تقنيات الحقن الذيل الوريد. عادة ، على الفئران الكبار يحتاج إلى البلعة حقن 100 UL - فلوريسئين ديكستران على 20 ملغ / مل في ملحي الفسيولوجية المناسبة. أفضل النتائج تأتي من حقن الصبغة بعد أن تم إدراج microprism في القشرة المخية الحديثة (بعد خطوة 2.16). باستخدام هذه التقنية يمكن للمرء أن يرى سفن أكبر من العيار الطبقات العميقة تمتد نحو الحنون والمتفرعة قبالة لتشكيل شبكة من microcapillaries (الشكل 4). ويقدر أفضل هذه الشبكة المعقدة من microcapillaries في القشرة المخية الحديثة باستخدام عالية الهدف الفتحة العددية (الشكل 5).
بالإضافة إلى ذلك ، فمن الممكن لقياس سرعة خلايا الدم الحمراء وتدفقها من الشعيرات الدموية العميقة القشرة المخية الحديثة عن طريق مسح الخط على طول سفينة (الشكل 6 ، خط أحمر في الصورة العليا). منذ خلايا الدم الحمراء حتى لا تأخذ صبغة الفلورسنت ، وسوف تظهر الشرائط السوداء. الصور التي تنتج عن فحص سطر لها البعد المكاني في أحد محاور والبعد الزماني في المحاور الأخرى (الشكل 6 ، الصورة السفلى). من هذه الصور ، يمكن للمرء حساب سرعة تدفق وخلايا الدم الحمراء عن طريق الشعيرات الدموية. في حالة الرقم 6 ، وقد تم قياس تدفق RBC لتكون كرات الدم الحمراء 36 / ثانية مع سرعة 0،45 ملم / ثانية. هذا ما يتفق مع نتائج من الأدب 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها IACUC جامعة ييل.
Acknowledgments
نشكر أنتوني Koleske J. ، دكتوراه عن توفير YFP الفئران.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| With enhanced silver reflective coating-(R77) | OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA) | 055-0010 | With enhanced silver reflective coating-(R77) |
| Fluorescein-dextran | Sigma-Aldrich | FD70 | 70 kDa |
| 0.28 NA, 4x air objective | Olympus Corporation | XLFLUOR 4x/340 | |
| 0.60 NA, 40x air objective | Olympus Corporation | LUCPLFLN | With 0-2 mm coverglass correction |
References
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).
