Summary
Em ângulo reto microprismas inserido no neocórtex do mouse permite a imagem profunda de múltiplas camadas cortical com um ponto de vista tipicamente encontrados em fatia. Um milímetro microprismas oferecer um campo de visão ampla (~ 900 mm) e resolução espacial suficiente para resolver as espinhas dendríticas. Demonstramos camada de imagem V neuronal e de imagem vascular neocortical usando microprismas.
Abstract
Nós apresentamos um protocolo para a imagem in vivo do tecido cortical usando uma sonda de imagem cerebral profunda na forma de um microprisma. Microprismas estão 1 mm em tamanho e têm um revestimento reflexivo sobre a hipotenusa para permitir reflexão interna de excitação e emissão de luz. A sonda microprisma simultaneamente imagens múltiplas camadas cortical com uma perspectiva tipicamente vistos apenas em preparações fatia. As imagens são coletados com um grande campo de visão (~ 900 mm). Além disso, nós fornecemos informações sobre o procedimento não-cirúrgico de sobrevivência e configuração microscópio. Resultados representativos incluem imagens de neurônios piramidais da camada V de Thy-1-H YFP camundongos mostrando suas dendrites apical estendendo-se através da camada superficial cortical e estendendo-se tufos. Resolução foi suficiente para espinhas dendríticas imagem perto do soma dos neurônios da camada V. A injeção de cauda veia de corante fluorescente revela a intrincada rede de vasos sanguíneos no córtex. Linha de varredura das células vermelhas do sangue (hemácias) que flui através dos capilares revela RBC velocidade e taxas de fluxo pode ser obtida. Esta sonda microprisma romance é um elegante, o método ainda nova e poderosa de visualizar profundas estruturas celulares e da função cortical in vivo.
Protocol
Parte 1: Optics Microprisma e Configuração do Microscópio
- O microprismas que usamos são de 1 mm, em ângulo reto prismas feitos de vidro comprado BK7 da Corporação Optosigma (Figura 1). Microprismas são tratadas usando uma pinça, sempre que possível.
- A hipotenusa do microprisma é revestido com prata aperfeiçoado para fornecer uma refletividade de mais de 97% 4-200 nm. Isto proporciona reflexão interna, tanto de luz de excitação do laser e da fluorescência emitida.
- Microprismas são sempre tratados com pinças, quando possível. As luvas são usadas em todos os momentos para manter o prisma limpo.
- Nós usamos uma custom-built microscópio de dois fotões capaz de pequenos animais de imagem. O animal, ligado ao dispositivo de estereotaxia, é colocado em um palco de 3 eixos motorizados.
- O microscópio está ligado a um PC Windows rodando software scanimage. Scanimage é um software de aquisição de imagem escritos em Matlab por Pologruto et al 1.
- Para geração de imagens microprisma, coletamos imagens com uma resolução de 1024 x 1024 ou 512 x 512 pixels. Além disso, nós tipicamente scan em 2 ms / linha ou 4 ms / linha.
- Dois tipos de objetivos são utilizados nos experimentos:
- A menor abertura numérica objetivo de ar (NA) para um largo campo de visão de imagem (veja a Tabela de Reagentes e Equipamentos).
- Um objetivo maior de ar NA com um colar de correção de vidro capazes de minimizar aberrações esféricas induzida por 0-2 mm de vidro (ver Tabela de Reagentes e Equipamentos).
- Quando o animal está pronto para a gráfica em um objetivo baixa ampliação, alinhar o padrão raster quadrados de varredura do laser com o topo da microprisma. Isso ajudará a orientar a imagem e fazer uso eficiente da potência do laser.
- Usando um objetivo maior NA com um colar de correção de vidro, coloque o colar de correção para corrigir a aproximadamente 1 mm de vidro. Uma vez que uma imagem fluorescente aparece durante o experimento, pode-se chegar com cuidado dentro do microscópio para otimizar o colar de correção para maximizar a resolução de imagem.
Parte 2: Non-sobrevivência Cirurgia Animal e Inclusão Microprisma
- A duração do procedimento completo, desde a incisão inicial até a conclusão de imagem, depende dos objetivos do experimento. No entanto, a colocação não-sobrevivência procedimento cirúrgico e microprisma pode ser esperado para levar cerca de 30-40 minutos para ser concluído.
- Camundongos (P30-P60) são pesados e anestesiados adequadamente usando uma injeção IP de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) para um plano adequado para procedimentos cirúrgicos.
- Ao longo de todo o experimento, o animal deve ser verificado a cada 15-20 minutos para avaliar o seu nível de anestesia. Se o animal reage a uma empresa toe pinch, uma dose suplementar de cetamina / xilazina é necessária. Tipicamente, uma dose suplementar é um terço da dose inicial e pode ser preparado com antecedência, em uma seringa para injeção IP imediato, se necessário.
- Uma vez que o mouse esteja devidamente anestesiado, a maioria dos pêlos sobre a cabeça do animal é raspado com um aparador com uma lâmina # 40.
- Nair ® é aplicado para os cabelos restantes na cabeça para ajudar a criar uma superfície livre de fios que podem ficar no caminho do microprisma durante o exame. Após 5 minutos, o ® é Nair limpos usando um cotonete.
- O animal anestesiado está devidamente colocada em um aparelho estereotáxico mouse. Durante os procedimentos cirúrgicos e sessões de imagem do animal é mantido em um cheio de água almofada de aquecimento fixado em 36 graus Celsius.
- Com a cabeça do animal corretamente fixada no local, uma incisão limpa é feito usando um bisturi para baixo da linha medial do crânio para separar a pele.
- Uma pequena quantidade de peróxido de hidrogênio 3% é colocado em um cotonete e aplicados ao crânio para limpar as membranas entre o crânio ea pele.
- O peróxido de hidrogênio também ajuda a revelar bregma, um marco importante em saber onde realizar a craniotomia e insira o microprisma.
- Antes da craniotomia é iniciado, as barras de ouvido e bar mordida estão adequadamente ajustadas para inclinar o crânio exposto de tal forma que é, basicamente, ao nível da mesa. Isso proporciona uma melhor plataforma para a craniotomia. Além disso, o que torna a superfície superior do prisma perpendicular com a luz de excitação de entrada. Isso ajudará a minimizar aberrações ópticas, enquanto imagem.
- A pequena rebarba dental (~ 0,8 tamanho da cabeça mm) é conectado a uma ferramenta Dremel ® usando um braço de extensão flexível. Para craniotomias, vamos definir a velocidade para cerca de 7.000 a 10.000 rpms.
- A broca dental é desnatado ao longo do crânio, até um groove praça é estabelecida no osso. Os lados do quadrado são aproximadamente 2-3 mm de comprimento e 1,5 centrada caudal mm e 1 mm lateral ao bregma.
- Continuar afinando o osso até uma pequena abertura é feita através do crânio. Um par de fórceps can levantar o retalho ósseo longe do crânio.
- A dura precisa ser removido antes da microprisma pode ser inserido no córtex. Sangramento é melhor controlada, permitindo que o sangue coagule na superfície por alguns minutos. Posteriormente, o sangue coagulado é removido com uma esponja cirúrgica antes de inserir o microprisma.
- Para ajudar a ajudar o alinhamento do prisma com o córtex, a face vertical do microprisma está alinhado paralelo com as alças do fórceps.
- Com o prisma corretamente realizada, o microprisma inteiro é inserido até o topo do prisma é nivelada com a superfície neocortical.
- Quando inserido corretamente, a microprisma deve permanecer na posição adequada. Qualquer hemorragia que resulta é mínima e pode ser absorvido com uma pequena esponja cirúrgica. Uma vez que o prisma está em vigor o animal está pronto para geração de imagens.
- Depois de um microprisma tem sido usado em um animal, ele pode ser reutilizado várias vezes. No entanto, ele não precisa ser devidamente limpo para remover qualquer material restante biológica. Isso pode ser feito por imersão do prisma em um pequeno volume de HCl ácido, seguida de um mergulho em metanol. O microprisma limpa pode então ser embrulhado em papel de lente até o uso futuro.
Parte 3: Resultados Representante
Figura 1: Imagens do microprisma em ângulo reto. Prismas usados neste experimento são um milímetro, prismas de vidro BK7 com um revestimento de prata reforçada com a hipotenusa para permitir reflexão interna de excitação e emissão de luz.
Figura 2: Imagem da camada V neurônios piramidais YFP. Imagem de campo de visão ampla com a microprisma revela uma grande população de corpos celulares piramidal ~ 800-900 mM de profundidade da superfície cortical. Além disso, dendrites apical estendendo-se até para a camada I também pode ser resolvido. Barra de escala = 200 mM.
Figura 3: Um objetivo maior abertura numérica usada em conjunto com o microprisma fornece resolução espacial suficiente para resolver as espinhas dendríticas nos dendritos apicais nos neurônios piramidais da camada V. Barra de escala = 10 mM.
Figura 4: Imagem obtida pela microprisma e uma cauda de injeção venosa de corante fluorescente. A imagem mostra vertical, vasos de grosso calibre, que se estende desde as regiões cerebrais profundas e capilares menores ramificando-se através do volume cortical. Barra de escala = 200 mM.
Figura 5: Usando um objetivo maior abertura numérica, a rede de capilares no neocórtex pode ser trabalhada com maior detalhe. Barra de escala = 50 mm.
Figura 6: microprismas também permite que as células vermelhas do sangue de imagem (hemácias) que flui através dos vasos. Hemácias não absorvem o corante fluorescente e, portanto, são vistos como listras escuras em todo o navio. Por linha de varredura em toda a embarcação, pode-se obter medições de fluxo e velocidade de RBC. Barra de escala = 10 mM (barra horizontal na imagem superior e inferior) e 250 ms (barra vertical na imagem em baixo).
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Discussion
Usando um microprisma em um experimento de imagens é relativamente simples e oferece muitas vantagens para os estudos in vivo sobre o neocórtex. Exemplos representativos usando esta técnica incluem imagens tiradas a partir de camundongos transgênicos expressando a proteína fluorescente nos neurônios da camada amarela V cortical. Usando microprismas pode-se ver uma coleção de grandes corpos celulares piramidais da camada V, cerca de 1 mm abaixo da superfície cortical. Visto também são os dendritos apicais que se estendem por todas as camadas superficial antes divergentes em tufos (Figura 2). Os ratos utilizados para estes experimentos são animais transgênicos desenvolvidas para expressar YFP apenas na camada de neurônios V (YFP-H 2). Usando esses ratos YFP-H e um objetivo maior abertura numérica com um colar de correção de vidro também é possível para a imagem dos dendritos com maior detalhe e resolver espinhas dendríticas (Figura 3).
Pode-se também rotular os vasos sanguíneos cortical com um corante fluorescente como a fluoresceína-dextran usando técnicas estabelecidas veia da cauda de injeção. Normalmente, para ratos adultos a 100 ul injeção em bolus de fluoresceína-dextran a 20 mg / ml em soro fisiológico é apropriado. Os melhores resultados vêm de injeção do corante após a microprisma foi inserido no neocórtex (após a etapa 2.16). Usando esta técnica pode-se ver os vasos de maior calibre de camadas profundas estendendo para a pia e ramificando-se para formar a rede de microcapilares (Figura 4). Dessa intrincada rede de microcapilares no neocórtex é melhor apreciado com um objetivo alta abertura numérica (Figura 5).
Além disso, é possível medir a velocidade de células vermelhas do sangue e fluxo do fundo capilares neocortical por linha de varredura de todo o comprimento de uma embarcação (Figura 6, linha vermelha na imagem de cima). Como as células vermelhas do sangue não ocupam o corante fluorescente, eles aparecerão como manchas escuras. Imagens que resultam de uma linha de varredura, têm uma dimensão espacial em um dos eixos e uma dimensão temporal em outros eixos (Figura 6, imagem em baixo). A partir dessas imagens, pode-se calcular o fluxo ea velocidade de células vermelhas do sangue através dos capilares. No caso da figura 6, o fluxo RBC foi medida a ser 36 hemácias / segundo com uma velocidade de 0,45 mm / segundo. Isto está de acordo com resultados da literatura 3.
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Disclosures
Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela IACUC da Universidade de Yale.
Acknowledgments
Agradecemos a Anthony J. Koleske, PhD para fornecer os ratos YFP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| With enhanced silver reflective coating-(R77) | OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA) | 055-0010 | With enhanced silver reflective coating-(R77) |
| Fluorescein-dextran | Sigma-Aldrich | FD70 | 70 kDa |
| 0.28 NA, 4x air objective | Olympus Corporation | XLFLUOR 4x/340 | |
| 0.60 NA, 40x air objective | Olympus Corporation | LUCPLFLN | With 0-2 mm coverglass correction |
References
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).
