Summary
Под прямым углом микропризм вставляется в коре головного мозга мыши позволяет производить глубокое изображение нескольких коркового слоя с точки зрения обычно можно найти в срез. Один-миллиметровых микропризм предлагаем широкое поле сектор обзора (~ 900 мкм) и пространственным разрешением достаточно для разрешения дендритных шипиков. Мы показываем слой V нейронов изображений и неокортекса сосудистой визуализации с использованием микропризм.
Abstract
Мы представляем протокол для прижизненного изображения корковой ткани с помощью глубокой сканирование мозга зонд в форме микропирамид. Микропризм являются 1-мм и отражающим покрытием на гипотенузе, чтобы внутреннее отражение возбуждения и испускания света. Микропирамид датчик изображения одновременно несколько слоев коры с перспективой как правило, рассматривается только в часть препаратов. Изображения, собранные с большого поля-обзора (~ 900 мкм). Кроме того, мы предоставляем информацию о не-выживания хирургической процедуры и микроскопа установки. Представитель результаты включают в себя изображения слоя V нейронов пирамидальной от Thy-1-H YFP мышей с указанием их дендритов, проходящий через поверхностный слой коры и расширения в пучки. Резолюция была достаточной для изображения дендритных шипиков возле сомы слоя нейронов V. Хвостовой вены инъекции флуоресцентного красителя показывает сложную сеть кровеносных сосудов в коре головного мозга. Линия сканирования красных кровяных телец (эритроцитов), протекающей через капилляры показывает РБК скорости потока и ставки могут быть получены. Этот роман зонд микропирамид является элегантным, но мощный новый метод визуализации глубоких клеточных структур и корковых функций в естественных условиях.
Protocol
Часть 1: микропирамид Оптика и микроскоп установки
- Микропризм которые мы используем, 1-мм, прямоугольные призмы изготовлены из стекла BK7 приобрести у Optosigma корпорации (рис. 1). Микропризм обрабатываются с помощью щипцов когда это возможно.
- Гипотенузы микропирамид покрыта серебряным с повышенной обеспечить отражательная способность больше, чем 97% от 400 - 2000 нм. Это обеспечивает внутреннее отражение света и лазерного возбуждения и излучается флуоресценции.
- Микропризм всегда обрабатываются с помощью щипцов, когда это возможно. Перчатки носить все время держать призму чисто.
- Мы используем заказ двухфотонного микроскопа способна малого животного изображений. Животных, прикрепленных к стереотаксической устройства, находится на 3-х осевой моторизованный стадии.
- Микроскоп подключается к ПК с Windows работает ScanImage программного обеспечения. ScanImage является получение изображений программное обеспечение, написанное в Matlab по Pologruto и др. 1.
- Для микропирамид изображений, которую мы получаем изображение с разрешением 1024 x 1024 или 512 х 512 пикселей. Кроме того, мы обычно сканирование с разрешением 2 мс / строка или 4 мс / линия.
- Два вида целей используются в экспериментах:
- Ниже числовой апертурой (NA) воздуха цель широкого поля-обзора изображения (см. таблицу реагентов и оборудования).
- Н. А. воздуха выше цели с воротником стекла коррекция способна минимизации сферических аберраций, индуцированных 0 - 2 мм из стекла (см. таблицу реагентов и оборудования).
- Когда животное готово для работы с изображениями при низких цель увеличения, выровнять площадь растрового сканирования образец лазера с верхней части микропирамид. Это поможет ориентироваться изображения и эффективного использования мощности лазера.
- Использование более высокого Н. А. объективом с воротником коррекции стекла, установить исправление воротник для коррекции примерно 1 мм из стекла. После флуоресцентное изображение появляется во время эксперимента, можно тщательно достичь внутри микроскопа для оптимизации коррекции воротник, чтобы максимально изображений разрешением.
Часть 2: Номера для выживания животных и хирургии микропирамид вставки
- Всей длине процедуру, начиная с первоначального разреза до завершения обработки изображений, зависит от целей эксперимента. Тем не менее, без хирургического вмешательства выживания и микропирамид размещения можно ожидать, что занимает примерно 30 - 40 минут.
- Мыши (P30-P60) взвешивают и анестезии надлежащим использованием IP-инъекции кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) до плоскости подходят для хирургических процедур.
- На протяжении всего эксперимента, животных следует проверять каждые 15-20 минут, чтобы оценить его уровень анестезии. Если животное реагирует на фирме схождения крайнем случае, дополнительный дозу кетамина / ксилазина не требуется. Обычно дополнительное доза одна треть начальной дозы и могут быть подготовлены заранее в шприце для немедленного IP-инъекции в случае необходимости.
- Как только мышь должным образом под наркозом, большинство волос на голове животного сбрил использовании триммера с № 40 лезвие.
- Наир ® наносится на оставшиеся волосы на голове, чтобы помочь создать поверхности свободны от волос, которые могут стать на пути из микропирамид во время съемки. Через 5 минут Наир ® убирается с помощью ватного тампона наконечником.
- Наркозом животного правильно помещается в устройство стереотаксической мыши. Во время хирургических операций и обработки изображений сессий животное удерживается на заполненном водой грелку установлена на уровне 36 градусов по Цельсию.
- С головы животного исправлена на месте, один чистый разрез делается с помощью скальпеля до средней линии черепа отделить кожу.
- Небольшое количество 3% перекись водорода находится на хлопок наконечником тампоном и наносят на черепе, чтобы убрать перепонки между черепом и кожей.
- Перекиси водорода и помогает выявить брегмы, важной вехой в зная, где для выполнения трепанации черепа и вставьте микропирамид.
- Перед краниотомии запуска ухо баров и укусить бар должным образом скорректирована с наклоном подвергается черепа, что это в основном на одном уровне с таблицей. Это обеспечивает лучшую платформу для трепанации черепа. Кроме того, это делает верхнюю поверхность призмы перпендикулярно входящего света возбуждения. Это поможет свести к минимуму оптические аберрации в то время как изображения.
- Небольшой стоматологической заусенцев (~ 0,8 мм, размер головы) связан с инструментом Dremel ®, используя гибкую руку расширение. Для craniotomies, мы устанавливаем скорость примерно до 7000 до 10000 оборотов.
- Стоматологических заусенцы является обезжиренное по черепу, пока квадратный паз устанавливается в кость. Сторон квадрата примерно 2-3 мм в длину и 1,5 в центре хвостовой мм и 1 мм, боковые брегмы.
- Продолжая истончение костей, пока небольшое отверстие производится через череп. Пара щипцов окн лифта костный лоскут от черепа.
- Длительность должна быть удалена перед микропирамид могут быть вставлены в коре головного мозга. Кровотечение лучше контролируется позволяя крови свертываться на поверхности в течение нескольких минут. Впоследствии, свернувшейся крови удаляется с помощью хирургического губкой, прежде чем вставлять микропирамид.
- Чтобы помочь выравнивание призма с корой, вертикальное лицом микропирамид выстраивается параллельно ручки щипцов.
- С призмой правильно проведены все микропирамид вставляется до вершины призмы на одном уровне с поверхностью коры головного мозга.
- Когда вставлена неправильно, микропирамид должны оставаться в правильном положении. Любое кровотечение, что результаты минимальны и могут быть покрыты с небольшой хирургической губки. После призмы на месте животное готово для работы с изображениями.
- После микропирамид была использована в животное, оно может быть повторно использована несколько раз. Тем не менее, она должна быть надлежащим образом очищены, чтобы удалить все оставшиеся биологического материала. Это может быть достигнуто путем погружения в призме небольшого объема соляной кислоты, а затем окунуться в метанол. Очищается микропирамид может быть завернуты в бумагу, пока объектив использования в будущем.
Часть 3: Представитель Результаты
Рисунок 1: Изображения прямоугольной микропирамид. Призмы, используемые в этом эксперименте одна миллиметра, BK7 призмы стекла с повышенной покрытие серебра на гипотенузу, чтобы внутреннее отражение возбуждения и испускания света.
Рисунок 2: Изображение слоя V YFP нейронов пирамидальные. Широкое поле сектор обзора изображения с микропирамид показывает большой популяции пирамидальных тел ячейки ~ 800 - 900 мкм из глубины поверхности коры. Кроме того, дендритов, простирающейся на слое я также может быть решена. Шкала бар = 200 мкм.
Рисунок 3: высшее числовой апертурой цели используется в сочетании с микропирамид обеспечивает пространственное разрешение достаточно для разрешения дендритных шипов на дендритов на слое V нейронов пирамидальные. Шкала бар = 10 мкм.
Рисунок 4: изображения, полученные с использованием микропирамид и хвостовой вены инъекции флуоресцентного красителя. Изображение показывает вертикальные, крупных сосудов калибра простирается от глубоких областей мозга и меньше капилляров отходящие через корковые объема. Шкала бар = 200 мкм.
Рисунок 5: Использование численных выше цели отверстие, сеть капилляров в коре головного мозга может быть, полученную с использованием более подробно. Шкала бар = 50 мкм.
Рисунок 6: микропризм также позволяет для работы с изображениями красных кровяных клеток (эритроцитов), протекающего через сосуды. Эритроциты не впитывают флуоресцентного красителя, и поэтому они видны как темные полосы поперек судна. По линейного сканирования через сосуд, можно получить измерения РБК потока и скорости. Шкала бар = 10 мкм (горизонтальная панель в верхней и нижней изображение) и 250 мс (вертикальная черта в нижнее изображение).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование микропирамид в визуализации эксперимент относительно проста и имеет много преимуществ для прижизненного исследования коры головного мозга. Типичными примерами использования этого метода включают изображения, полученные из трансгенных мышей, экспрессирующих желтый флуоресцентный белок в слое V корковые нейроны. Использование микропризм можно увидеть коллекцию больших пирамидальных тел ячейки в слое V, около 1 мм ниже поверхности коры. Также видел, дендритов, которые простираются через все поверхностные слои, прежде чем расходятся в пучки (рис. 2). Мышей, используемых для этих экспериментов трансгенных животных, предназначенные для выражения YFP только в слое V нейронов (YFP-H 2). Используя эти YFP-H мышей и выше численные цели отверстие с воротником коррекции стекло можно также имиджу дендриты с большей детализацией и решить дендритных шипиков (рис. 3).
Можно также этикетки корковых сосудов с флуоресцентным красителем, таких как флуоресцеин-декстран с использованием установленных хвостовой вены методы инъекций. Как правило, для взрослых мышей 100 мкл болюсной инъекции флуоресцеина-декстран в дозе 20 мг / мл в физиологическом растворе является целесообразным. Лучшие результаты получаются от инъекционных красителя после микропирамид был вставлен в коре головного мозга (после шага 2.16). Используя эту технику можно увидеть большего калибра сосудов из глубоких слоев расширения к мягкой и отходящие сформировать сеть микрокапилляров (рис. 4). Это сложная сеть микрокапилляров в коре головного мозга лучше оценили использованием высокой числовой апертуре объектива (рис. 5).
Кроме того, можно измерить скорость красные клетки крови и поток из глубин неокортекса капилляров линейного сканирования по длине судна (рис. 6, красная линия в верхнем изображении). Так как красные кровяные клетки не занимают флуоресцентный краситель, они будут выглядеть как темные полосы. Изображения, которые следуют из линейного сканирования имеют пространственное измерение в одной оси и временное измерение в других осей (рис. 6, снизу изображения). Из этих образов, можно вычислить и скорость потока эритроцитов в крови через капилляр. В случае рисунке 6, поток РБК было измерено, 36 эритроцитов / сек со скоростью 0,45 мм / сек. Это согласуется с результатами литературы 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными IACUC Йельского университета.
Acknowledgments
Мы благодарим Энтони Дж. Koleske, доктор философии за предоставление YFP мышей.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| With enhanced silver reflective coating-(R77) | OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA) | 055-0010 | With enhanced silver reflective coating-(R77) |
| Fluorescein-dextran | Sigma-Aldrich | FD70 | 70 kDa |
| 0.28 NA, 4x air objective | Olympus Corporation | XLFLUOR 4x/340 | |
| 0.60 NA, 40x air objective | Olympus Corporation | LUCPLFLN | With 0-2 mm coverglass correction |
References
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).
