L'imagerie in vivo de Deep couches corticales utilisant un microprisme

Summary

À angle droit microprismes inséré dans le néocortex de souris permet d'imagerie profonde de plusieurs couches corticales avec un point de vue on trouve généralement dans les tranches. Un millimètre microprismes offrent un champ de vision large (~ 900 um) et des résolutions spatiales suffisantes pour résoudre les épines dendritiques. Nous démontrons la couche V imagerie neuronale et néocorticale imagerie vasculaire en utilisant microprismes.

Abstract

Nous présentons un protocole pour l'imagerie in vivo du tissu cortical en utilisant une sonde d'imagerie cérébrale profonde dans la forme d'un microprisme. Microprismes sont de 1 mm en taille et ont un revêtement réfléchissant sur l'hypoténuse pour permettre une réflexion interne de l'excitation et l'émission de lumière. La sonde microprismes simultanément plusieurs images couches corticales avec une perspective typiquement observée uniquement dans les préparations tranche. Les images sont recueillies avec un grand champ de vue (~ 900 um). En outre, nous fournissons des détails sur la procédure de non-chirurgical et la survie de configuration de microscope. Les résultats représentatifs comprennent des images de neurones pyramidaux couche V de Thy-1-H YFP souris montrant leurs dendrites apicales qui s'étend à travers la couche superficielle du cortex et s'étendant dans des touffes. Résolution a été suffisante pour épines dendritiques image proche du soma des neurones V couche. Une injection de queue veine de colorant fluorescent révèle le réseau complexe de vaisseaux sanguins dans le cortex. À balayage linéaire de globules rouges (hématies) qui coule à travers les capillaires révèle la vitesse de RBC et les taux de flux peuvent être obtenues. Cette sonde microprismes roman est un élégant mais puissant méthode nouvelle de visualiser en profondeur les structures cellulaires et la fonction corticale in vivo.

Protocol

Partie 1: Optique microprismes et de configuration de microscope

1. Les microprismes que nous utilisons sont de 1 mm, angle droit prismes à base de verre BK7 achetés auprès de la Société Optosigma (figure 1). Microprismes sont traitées en utilisant une pince quand c'est possible.
2. L'hypoténuse du microprismes est revêtu d'argent améliorée afin de fournir une réflectivité supérieure à 97% de 400 à 2000 nm. Ceci fournit une réflexion interne à la fois la lumière d'excitation laser et la fluorescence émise.
3. Microprismes sont toujours traités en utilisant une pince quand c'est possible. Les gants sont portés en tout temps pour garder le prisme propre.
4. Nous utilisons une coutume construit microscope à deux photons capables d'imagerie du petit animal. L'animal, attaché à l'appareil de stéréotaxie, est placé sur une scène à 3 axes motorisés.
5. Le microscope est connecté à un PC Windows exécutant le logiciel scanimage. Scanimage est un logiciel d'acquisition d'image écrit en Matlab par Pologruto et al ^1.
6. Pour l'imagerie microprismes, nous recueillons des images à une résolution de 1024 x 1024 ou 512 x 512 pixels. De plus, nous avons généralement scan à 2 ms / ligne ou 4 ms / ligne.
7. Deux types d'objectifs sont utilisés dans les expériences:
   • Inférieure un objectif chiffré de l'air d'ouverture (NA) pour grand champ de vision d'imagerie (voir tableau des réactifs et des équipements).
   • Un objectif plus élevé de l'air NA avec un collier de verre de correction susceptible de minimiser les aberrations sphériques induites par 0 - 2 mm de verre (voir le tableau des réactifs et des équipements).
8. Lorsque l'animal est prêt pour l'imagerie sous un objectif à faible grossissement, d'aligner le modèle raster carrés de balayage du laser avec le haut de la microprismes. Cela aidera à orienter l'image et de faire une utilisation efficace de la puissance du laser.
9. En utilisant un objectif plus élevé NA avec un collier de verre de correction, régler la bague de correction pour corriger environ 1 mm de verre. Une fois une image fluorescente apparaît pendant l'expérience, on peut bien accéder à l'intérieur du microscope pour optimiser la bague de correction afin de maximiser la résolution d'imagerie.

Partie 2: La chirurgie des animaux non-survie et d'insertion microprismes

1. La longueur entière procédure, à partir de l'incision initiale jusqu'à l'achèvement de l'imagerie, dépend des objectifs de l'expérience. Cependant, le placement non-intervention chirurgicale et la survie de microprismes peuvent être devrait prendre environ 30 - 40 minutes à compléter.
2. Souris (P30-P60) sont pesés et anesthésiés appropriée en utilisant une injection IP de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) à un plan approprié pour les procédures chirurgicales.
3. Tout au long de toute l'expérience, l'animal doit être vérifié toutes les 15-20 minutes pour évaluer son niveau de l'anesthésie. Si l'animal réagit à une entreprise toe-pincement, une dose supplémentaire de kétamine / xylazine est nécessaire. Généralement, une dose supplémentaire est d'un tiers de la dose initiale et peut être préparé à l'avance dans une seringue pour injection IP immédiat si nécessaire.
4. Une fois que la souris est correctement anesthésié, la majorité des cheveux sur la tête de l'animal est rasé en utilisant un potentiomètre avec une lame # 40.
5. Nair ® est appliqué aux poils restant sur la tête pour aider à créer une surface libre de poils qui peuvent obtenir de la manière de l'microprismes pendant l'imagerie. Après 5 minutes, le Nair ® est nettoyée en utilisant un coton-tige.
6. L'animal anesthésié est correctement placé dans un appareil stéréotaxique de la souris. Pendant les procédures chirurgicales et des séances d'imagerie est gardé l'animal sur un rempli d'eau coussin chauffant réglé à 36 degrés Celsius.
7. Avec tête de l'animal soit correctement fixé, une incision propre est faite en utilisant un scalpel sur la ligne médiane du crâne de séparer la peau.
8. Une petite quantité de peroxyde d'hydrogène à 3% est placée sur un coton-tige et appliqué sur le crâne pour déblayer les membranes entre le crâne et la peau.
9. Le peroxyde d'hydrogène permet également de révéler bregma, un jalon important de savoir où effectuer la craniotomie et insérez le microprismes.
10. Avant la craniotomie est démarré, les barres d'oreille bouchée et un bar sont correctement ajustés à l'inclinaison de la boîte crânienne exposée telle qu'elle est essentiellement au niveau du tableau. Cela fournit une meilleure plateforme pour la craniotomie. De plus, ce qui rend la surface supérieure de la perpendiculaire prisme à la lumière d'excitation entrants. Cela permettra de minimiser les aberrations optiques tout en imagerie.
11. Une petite bavure dentaires (~ 0,8 mm taille de la tête) est connecté à un outil de Dremel ® à l'aide d'un bras flexible de prolongation. Pour craniotomies, nous avons mis la vitesse à environ 7.000 à 10.000 RPM.
12. La fraise dentaire est écrémé le long du crâne jusqu'à une rainure carrée est établie dans l'os. Les côtés du carré sont environ 2-3 mm de longueur et 1,5 centré caudale et 1 mm latéral bregma.
13. Poursuivant l'amincissement de l'os jusqu'à ce qu'une petite ouverture se fait à travers le crâne. Une paire de pinces à can soulever le volet osseux loin du crâne.
14. La durée doit être enlevé avant que le microprismes peuvent être insérés dans le cortex. Le saignement est mieux contrôlée en laissant le sang coagule à la surface pendant plusieurs minutes. Ensuite, le sang coagulé est enlevée à l'aide d'une éponge chirurgicale avant d'insérer la microprismes.
15. Pour aider à faciliter l'alignement du prisme avec le cortex, la face verticale de la microprismes est aligné parallèlement à la poignée sur la pince.
16. Avec le prisme bien tenu, les microprismes ensemble est inséré jusqu'au sommet du prisme est au ras de la surface du néocortex.
17. Lorsqu'elle est insérée correctement, les microprismes doit rester dans la bonne position. Tout saignement qui en résulte est minime et peut être absorbé avec une petite éponge chirurgicale. Une fois le prisme est en place l'animal est prêt pour l'imagerie.
18. Après un microprisme a été utilisé dans un animal, il peut être réutilisé plusieurs fois. Toutefois, il ne doivent être correctement nettoyées pour éliminer tout résidu biologique. Ceci peut être accompli en trempant le prisme dans un petit volume d'acide HCl, suivie par un plongeon dans le méthanol. Les microprismes peuvent ensuite être nettoyé enveloppés dans du papier lentille jusqu'à une utilisation future.

Partie 3: Résultats Représentant

Figure 1: Images de l'microprismes à angle droit. Prismes utilisés dans cette expérience sont d'un millimètre, des prismes de verre BK7 avec un revêtement en argent renforcée sur l'hypoténuse pour permettre une réflexion interne de l'excitation et l'émission de lumière.

Figure 2: Image de la couche de neurones pyramidaux V YFP. Large champ de vision avec l'imagerie microprismes révèle une grande population de corps cellulaires pyramidaux ~ 800 à 900 um de profondeur de la surface corticale. En outre, les dendrites apicales s'étendant jusqu'à vers la couche I peuvent également être résolus. Barre d'échelle = 200 pm.

Figure 3: Un objectif d'ouverture numérique élevée utilisés en conjonction avec les microprismes fournit une résolution spatiale suffisante pour résoudre les épines dendritiques sur les dendrites apicales des neurones pyramidaux couche V. Barre d'échelle = 10 um.

Figure 4: Une image obtenue en utilisant les microprismes et une injection de queue veine d'un colorant fluorescent. L'image montre verticales, les navires de gros calibre qui s'étend de régions profondes du cerveau et les petits capillaires bifurquant à travers le volume cortical. Barre d'échelle = 200 pm.

Figure 5: Utilisation d'un objectif plus élevé ouverture numérique, le réseau de capillaires dans le néocortex peuvent être imagées avec plus de détails. Barre d'échelle = 50 microns.

Figure 6: microprismes permet aussi pour les cellules sanguines d'imagerie rouges (hématies) circulant dans les vaisseaux. Globules rouges n'absorbent pas le colorant fluorescent et sont donc considérés comme des rayures foncées sur le navire. En ligne de balayage dans le récipient, on peut obtenir des mesures de flux de RBC et de vitesse. Barre d'échelle = 10 microns (barre horizontale à l'image de haut et bas) et 250 ms (barre verticale à l'image de fond).

Discussion

Utiliser un microprisme dans une expérience d'imagerie est relativement simple et offre de nombreux avantages pour les études in vivo sur le néocortex. Des exemples représentatifs en utilisant cette technique comprennent des images prises à partir des souris transgéniques exprimant une protéine fluorescente jaune dans les neurones V couche corticale. Utiliser microprismes, on peut voir une collection de grands corps des cellules pyramidales dans la couche V, près de 1 mm en dessous de la surface corticale. On voit également sont les dendrites apicales qui s'étendent à travers toutes les couches superficielles avant de diverger dans les touffes (figure 2). Les souris utilisées pour ces expériences sont des animaux transgéniques conçues pour exprimer YFP uniquement dans la couche V neurones (YFP-H ^2). L'utilisation de ces souris YFP-H et un objectif d'ouverture numérique élevée avec un collier de verre de correction, il est également possible de l'image des dendrites avec plus de détail et de résoudre les épines dendritiques (figure 3).

On peut aussi étiqueter les vaisseaux sanguins corticale avec un colorant fluorescent comme la fluorescéine-dextrane en utilisant des techniques d'injection queue veine. Typiquement, pour une injection chez la souris adulte bolus de 100 ul de la fluorescéine-dextran à 20 mg / ml dans du sérum physiologique est approprié. Les meilleurs résultats proviennent de l'injection du colorant après l'microprismes a été inséré dans le néocortex (après l'étape 2.16). En utilisant cette technique, on peut voir les vaisseaux de calibre plus large à partir des couches profondes s'étendant vers la pie-mère et de bifurquer pour former le réseau des microcapillaires (figure 4). Ce réseau complexe de microcapillaires dans le néocortex est mieux appréciée en utilisant un objectif d'ouverture numérique élevée (figure 5).

En outre, il est possible de mesurer la vitesse des cellules rouges du sang et le flux du plus profond du néocortex capillaires par ligne de balayage le long de la longueur d'un navire (figure 6, la ligne rouge à l'image du haut). Depuis les globules rouges ne prennent pas le colorant fluorescent, ils apparaissent comme des stries sombres. Les images qui résultent d'un balayage linéaire ont une dimension spatiale dans un des axes et une dimension temporelle dans les autres axes (figure 6, l'image du bas). A partir de ces images, on peut calculer le flux et la vitesse des globules rouges dans le capillaire. Dans le cas de la figure 6, le flux de RBC a été mesurée à 36 globules rouges / seconde avec une vitesse de 0,45 mm / seconde. Ceci est en accord avec les résultats de la littérature ^3.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
With enhanced silver reflective coating-(R77)	OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)	055-0010	With enhanced silver reflective coating-(R77)
Fluorescein-dextran	Sigma-Aldrich	FD70	70 kDa
0.28 NA, 4x air objective	Olympus Corporation	XLFLUOR 4x/340
0.60 NA, 40x air objective	Olympus Corporation	LUCPLFLN	With 0-2 mm coverglass correction