Summary
Karyotyping एक सरल और उपयोगी तकनीक आनुवंशिक परिवर्तन का पता लगाने के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया है. यहाँ हम गुणसूत्र इन संस्कृति में बनाए रखा कोशिकाओं के गुणसूत्र स्थिति की निगरानी के लिए मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के प्रसार को तैयार करने के लिए कदम प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम का वर्णन है.
Abstract
हालांकि मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESC) के लिए एक स्थिर द्विगुणित 1 karyotype वर्तमान दिखाया गया है, कई अध्ययनों की रिपोर्ट है कि संस्कृति शर्तों के आधार पर वे जैसे पूरे या गुणसूत्रों के कुछ हिस्सों के अलावा गुणसूत्र विसंगतियों के अधिग्रहण के लिए प्रवण हो. दरअसल, लंबे समय तक संस्कृति के दौरान, karyotypic परिवर्तन जब enzymatic या रासायनिक वियोजन 2,3,4 उपयोग किया जाता है मनाया जाता है, जबकि passaging के लिए कालोनियों के मैनुअल विच्छेदन एक स्थिर 5 karyotype बरकरार रखती है . इसके अलावा, फीडर कोशिकाओं को हटाने के रूप में वातावरण में परिवर्तन भी 3,6 hESC की आनुवंशिक अखंडता के साथ समझौता करने लगते हैं. एक बार गुणसूत्र परिवर्तन सेलुलर फिजियोलॉजी प्रभावित करती है, embryogenesis अध्ययन और नशीली दवाओं के परीक्षण में एक अनिवार्य उपकरण के रूप में इन विट्रो में hESC की आनुवंशिक अखंडता के लक्षण वर्णन हो सकता है हो सकता है महत्वपूर्ण पर विचार hESC. इसके अलावा, भविष्य चिकित्सकीय प्रयोजनों के लिए गुणसूत्र में परिवर्तन के रूप में यह अक्सर carcinogenesis के लिए जुड़ा हुआ है एक असली चिंता का विषय हैं.
यहाँ हम एक सरल और उपयोगी विधि जी बैंडिंग, मछली स्काई, या CGH 7,8 तकनीक द्वारा निर्धारित गुणसूत्र के बाद विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता गुणसूत्र फैलता प्राप्त दिखाओ . हम गुणसूत्र स्थिति 5 passages के अंतराल के साथ नियमित जाँच की सिफारिश क्रम में translocations और aneuploidies की उपस्थिति की निगरानी
Priscila Britto और Rafaela Sartore कागज को समान रूप से योगदान दिया.
Protocol
उपकरणों
- टिशू कल्चर इनक्यूबेटर, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2
- अपकेंद्रित्र
- Micropipettors (100 100μL) सेट
- जल 37 स्नान डिग्री सेल्सियस
- जल स्नान 90 ° सी भाप पानी का स्रोत हो सकता है
- चरण विपरीत खुर्दबीन
पहला कदम
Colcemid के साथ कोशिकाओं के इलाज
इस प्रक्रिया में हम hESC H9 लाइन माउस भ्रूणीय (MEF) fibroblasts mitomycin सी (सिग्मा) के साथ निष्क्रिय और DMEM/F12 (Invitrogen) में बनाए रखा पर सुसंस्कृत का इस्तेमाल किया 20% पीटा सीरम (KSR, Gibco) प्रतिस्थापन और 8ng/mL के साथ पूरक fibroblast वृद्धि कारक (FGF-2, आर एंड डी).
आदेश में metaphases फैलता की एक बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए, यह उच्च mitotic सूचकांक में जो वहाँ कई कोशिकाओं को विभाजित कर रहे हैं के साथ संस्कृतियों का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.
- इनक्यूबेटर से संस्कृति फ्लास्क ले लो और, लामिना का प्रवाह में, 0,1 μg / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता पर Colcemid जोड़ने.
- इनक्यूबेटर के लिए फ्लास्क लौटें और 3 घंटे की प्रतीक्षा है ताकि अवरोध करनेवाला मेटाफ़ेज़, जब गुणसूत्रों में अच्छी तरह से और गाढ़ा खुर्दबीन के नीचे आसानी से देखे जा सकते हैं पर mitotic गिरफ्तारी पैदा कर सकता है.
कोशिकाओं फिक्सिंग
- मध्यम बाहर ले लो और / tripsin EDTA 0.05% करने के लिए कोशिकाओं की सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त जोड़ने. कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं और फिर एंजाइम संस्कृति के माध्यम जोड़ने सीरम युक्त द्वारा या बस कोशिकाओं को सीरम जोड़कर या तो निष्क्रिय करने की अनुमति दें.
नोट: यह महत्वपूर्ण है को यकीन है कि एक एकल कक्ष निलंबन अच्छा मेटाफ़ेज़ फैलता प्राप्त करने के लिए हासिल की है. - 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब और 5 मिनट के लिए 122 ग्राम पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं स्थानांतरण.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें, 200 एमएल के बारे में छोड़ रहा है, और गोली ट्यूब, के रूप में वीडियो में दिखाया गया है दोहन द्वारा धीरे resuspend. यकीन है कि कोशिकाओं को अच्छी तरह से अलग हैं, तो आप समाधान में किसी भी clumps कल्पना नहीं कर सकते हैं.
- अगले आप hypotonic समाधान के 5 एमएल (KCl 75mm) 37 पूर्व गरम डिग्री सेल्सियस, धीरे धीरे, के रूप में निम्नलिखित विवरण में ट्यूब दीवार से. जोड़ने की आवश्यकता होगी पहले 3 मिलीलीटर जोड़ने, ट्यूब पलटना एक क्षैतिज स्थिति के लिए सिर्फ कोशिकाओं hypotonic समाधान के साथ मिश्रण तो शेष 2 मिलीलीटर जोड़ने और 37 में गर्म रखने ° C 15 मिनट के लिए.
नोट: इस बिंदु पर hypotonic समाधान सेलुलर मात्रा पर एक वृद्धि का कारण और क्रोमोसोम सुलझाना में मदद करेगा. ऊष्मायन समय के लिए अच्छा गुणसूत्र फैलता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि समय बहुत लंबा है, कोशिका झिल्ली बहुत जल्दी है और क्रोमोसोम खो रहे हैं फट सकता है. यदि बहुत छोटा है, यह गुणसूत्र फैलता प्राप्त क्योंकि कोशिका झिल्ली बाधित नहीं हो सकता है मुश्किल हो सकता है. - लगानेवाला समाधान (मेथनॉल / हिमनदों एसिटिक एसिड 03:01) के 3 बूँदें जोड़ें, ट्यूब धीरे पलटना और कोशिकाओं को तोड़ने के बिना 5 मिनट के लिए 122 ग्राम अपकेंद्रित्र के साथ लगानेवाला समाधान मिश्रण.
नोट: लगानेवाला समाधान हौसले से बनाया जाना चाहिए.
नोट: यह महत्वपूर्ण है को तोड़ने के बिना कोशिकाओं उदासीनता से बचने centrifugation का उपयोग करें, सामग्री के नुकसान को रोकने. - सतह पर तैरनेवाला त्यागें, 200 एमएल के बारे में छोड़ रहा है, और गोली ट्यूब के नीचे दोहन से धीरे resuspend.
नोट: फिर, यकीन है कि कोशिकाओं को अच्छी तरह से अलग हैं, तो आप समाधान में किसी भी clumps कल्पना नहीं कर सकते हैं. - लगानेवाला समाधान के पहले 3 एमएल जोड़ें, धीरे धीरे ट्यूब दीवार से, जबकि आप ट्यूब बारी बारी से. एक क्षैतिज स्थिति के लिए ट्यूब उलटें बस मिश्रण करने के लिए कोशिकाओं, और तब ट्यूब दीवार से लगानेवाला समाधान के 2 एमएल जोड़ने के लिए कोशिकाओं को नीचे ले जाओ. 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर स्टॉक.
नोट: तय कोशिकाओं लगानेवाला समाधान में महीनों के लिए 4 में संग्रहीत किया जा सकता है डिग्री सेल्सियस उनके सूजन राज्य में कोशिकाओं की रक्षा के अलावा, लगानेवाला समाधान लिपिड और प्रोटीन denatures निकालता है. इन घटनाओं कोशिका झिल्ली कमजोर बनाने के लिए और, एक परिणाम के रूप में, गुणसूत्र आसानी से फैल कर.
स्लाइड्स कांच की सफाई
अपने गुणसूत्र फैलता है सुनिश्चित करें कि अपनी स्लाइड्स को ठीक से या साफ कर रहे हैं आप कुछ नाभिक खो सकता है और भी metaphases शुरू करने से पहले. इस कदम के रूप में अच्छी तरह से महत्वपूर्ण है अगर आप किसी भी संकरण 9 तकनीक की कोशिश करना चाहते हैं.
- प्लेस एक बीकर युक्त कमरे के तापमान पर कम से कम 3 घंटे के लिए 6M एचसीएल में स्लाइड.
- इस समय के बाद, 10 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में स्लाइड्स धो लो.
- आसुत जल में स्लाइड्स कुल्ला और वे कमरे के तापमान पर शुष्क.
- अब स्लाइड्स 96% इथेनॉल में संग्रहीत किया जा सकता है और एक प्रकार का वृक्ष मुक्त तुरंत उपयोग करने के लिए पूर्व के साथ सूख.
नोट: के लिए स्वस्थानी संकरण विधियों में, स्लाइड अधिक से अधिक 2 दिनों के लिए 96% इथेनॉल में संग्रहीत नहीं किया जा सकता है
दूसरा कदम
कोशिकाओं धुलाई
- अगले दिन, को तोड़ने के बिना 5 मिनट के लिए 122 ग्राम कोशिकाओं अपकेंद्रित्र .
- डी200 मिलीग्राम के बारे में जाने से सतह पर तैरनेवाला iscard. धीरे ट्यूब तो ताजा लगानेवाला समाधान के 5 मिलीलीटर (मेथनॉल / हिमनदों एसिटिक एसिड 03:01) जोड़ने के लिए, धीरे धीरे जबकि ट्यूब घूर्णन ट्यूब दीवार से flicking द्वारा गोली Resuspend. दोहराएँ इस धोने तीन washes के एक कुल के लिए 2 से अधिक बार कदम.
नोट: लगानेवाला समाधान हौसले से बनाया जाना चाहिए.
स्लाइड्स की तैयारी
- पिछले centrifugation कदम पर समाधान के लिए सेल गोली homogenize और स्लाइड्स में कोशिकाओं की पर्याप्त घनत्व प्राप्त करने के (1 आंकड़ा देखें) के लिए पर्याप्त मात्रा में छोड़ दें.
- एक साफ सूखी स्लाइड पर बहुत करीब है और सतह के समानांतर विंदुक हिल द्वारा सेल निलंबन के 20-30 μL जोड़ें. लगानेवाला समाधान evaporates के रूप में, स्लाइड की सतह दानेदार बन जाता है.
- तत्काल, स्लाइड बेनकाब, ऊपर का सामना करना है, गर्म पानी की भाप (90 °) में 30 सेकंड के लिए के कारण कोशिकाओं को झटका.
नोट: इस समय, लगानेवाला समाधान evaporates से मेथनॉल, एक वृद्धि एसिटिक एसिड एकाग्रता में जिसके परिणामस्वरूप, पानी के साथ मिलकर जो फैल गुणसूत्र को उत्तेजित करता है. - सिर्फ अगर एकाग्रता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल वितरण अच्छा है (1 आंकड़ा देखें) की जांच करने के लिए एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप को देखो.
- अब स्लाइड्स जी बैंडिंग (Giemsa), मछली स्काई, या CGH के रूप में cytogenetics दृष्टिकोण द्वारा गुणसूत्रों के सेट की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार हैं.
महत्वपूर्ण संकेत
कैसे एक पर्याप्त विश्लेषण किया जा मेटाफ़ेज़ चुनते
गोल और अलग metaphases (आंकड़ा 2 डी) का चयन, आप द्वारा उत्पन्न दो या अधिक गुणसूत्रों का लाभ एक साथ मिश्रित या एक शुरू गुणसूत्र द्वारा उत्पन्न क्रोमोसोम के नुकसान से फैलता है के रूप में झूठी aneuploidies पर विचार करने से बचने कर सकते हैं. तो, नाभिक के पास metaphases चुनने है क्योंकि कुछ क्रोमोसोम उन्हें (आंकड़ा 2A और 2B) द्वारा छिपा हो सकता है है से बचने के. इसके अलावा, दौर metaphases के लिए देखो और सुनिश्चित करें कि किसी भी गुणसूत्र मेटाफ़ेज़ (आंकड़ा 2C) से अलग है.
फीडर कोशिकाओं और hESC karyotype
जी बैंडिंग और स्काई विश्लेषण के लिए, hESC संस्कृति में फीडर कोशिकाओं की उपस्थिति परिणामों के साथ हस्तक्षेप नहीं करता, क्योंकि फीडर कोशिकाओं को विभाजित राज्य (mitomycin सी या विकिरण द्वारा निष्क्रिय) के अंतर्गत नहीं हैं और मेटाफ़ेज़ आबादी का हिस्सा नहीं होगा. हालांकि, interphase नाभिक में मछली तकनीक के अनुप्रयोग के लिए, यह फीडर कोशिकाओं से कालोनियों मैन्युअल रूप से मछली विश्लेषण के लिए trypsinization पहले कटाई hESC जनसंख्या अलग पसंद है.
चित्रा 1: स्लाइड्स में उचित सेल घनत्व कैसे पता है. चरण 10x उद्देश्य के विपरीत सूक्ष्मदर्शी की छवियाँ. (ए) सेल घनत्व बहुत अधिक है. तीर को फैलाता मेटाफ़ेज़ भी नाभिक के करीब बिंदु. (बी) अच्छी सेल घनत्व के साथ एक स्लाइड. हलकों metaphases नाभिक या अन्य metaphases से अलग फैलता है दिखाते हैं. कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.
चित्रा 2: कैसे चुन करने के लिए पर्याप्त विश्लेषण किया जा मेटाफ़ेज़. गुणसूत्रों DAPI और 100x उद्देश्य में एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के द्वारा प्राप्त छवियों के साथ दाग रहे हैं. (ए) (बी) नाभिक के पास metaphases (तीर द्वारा इंगित) (सी) से बचें और दौर है कि वर्तमान गुणसूत्रों अलग नहीं metaphases (सर्कल). (डी) एक दौर मेटाफ़ेज़ एक अच्छा विश्लेषण किया जा मेटाफ़ेज़ है. कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 2 का एक बड़ा संस्करण देख.
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Discussion
गुणसूत्र फैलता की तैयारी जी बैंडिंग, और मछली, स्काई और CGH जैसे अधिक परिष्कृत तकनीक के रूप में नियमित तकनीक के द्वारा एक भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के आनुवंशिक स्थिति के सफल विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है.
यह प्रक्रिया colcemid ऊष्मायन है, जो कोशिका चक्र लंबाई पर निर्भर करता है की अवधि के द्वारा अलग कई प्रकार की कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है. भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की कालोनियों के लिए, हम 3 घंटे प्रतीक्षा जबकि embryoid निकायों के लिए (EB) इस समय 6 घंटे तक किया जा सकता है है.
सेल समुच्चय (embryoid निकायों की तरह) तुम बहुत अच्छी तरह से अलग कर देना क्रम में एक एकल कोशिका समाधान प्राप्त की आवश्यकता होगी के साथ काम करने के मामले में. इस मामले में, trypsin और यांत्रिक हदबंदी के बाद, आप एक 40μm नायलॉन सेल झरनी (बी बायोसाइंसेज) का उपयोग कर और तब प्रक्रिया के अनुक्रम (प्रक्रियाओं के विषय के चरण 4 से).
यहाँ प्रक्रिया में वर्णित यह देखते हुए कि सेल निलंबन "बारीकी" स्लाइड्स पर गिरा दिया जाता है आदेश में अत्यधिक से बचने के गुणसूत्रों के प्रसार और कलाकृतियों के फलस्वरूप पीढ़ी के लायक है.
हम मानते हैं कि इस प्रोटोकॉल एक उपयोगी और सरल के लिए नियमित रूप से न केवल भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के साथ निपटने प्रयोगशालाओं द्वारा, लेकिन अन्य स्टेम कोशिकाओं में गुणसूत्र अस्थिरता का अध्ययन करने में रुचि रखते अन्य जांचकर्ताओं द्वारा लागू किया जा उपकरण है.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Techno Plastic Products | 91015 | |
| Colcemid Karyo MAX | GIBCO, by Life Technologies | 15212-012 | |
| EDTA | Isofar | 721 | |
| Glacial acetic acid | Isofar | 100 | |
| Methanol | Isofar | 208 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck & Co., Inc. | 104.931.000 | |
| Slide | Bioslide | 7105-1 | |
| Tripsin | Sigma-Aldrich | T4799 |
References
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).
- Draper, J. S. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).
- Maitra, A. Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells. Nat Genet. 37 (10), 1099-1099 (2005).
- Mitalipova, M. M. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-19 (2005).
- Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nat Biotechnol. 22 (4), 381-381 (2004).
- Caisander, G. Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture. Chromosome Res. 14 (2), 131-131 (2006).
- Imreh, M. P. In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells. J Cell Biochem. 99 (2), 508-508 (2006).
- Robin-Wesselschmidt, J. L. Human Stem Cell Manual. Loring, J. F., Robin-Wesselschmidt, J. L., Robin-Wesselschmidt, S. chwartz , Elsevier's Science & Technology Rights. California. 59-59 (2007).
- Rooney, D. E. Human Cytogenetics. , Third Edition, Oxford University Press. (2001).
- Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. Practical in situ hybridization. Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. 51-51 (2000).
