Summary
हम एक नए सर्वेक्षण स्कैन electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ईएसआई / एमएस) का उपयोग खमीर में कई लिपिड प्रजातियों की पहचान करने के लिए मात्रात्मक lipidomics विधि का वर्णन. इस विधि वर्तमान लिपिड पहचान और लिपिड, संवेदनशीलता, और गति के विभिन्न आणविक रूपों को हल करने की क्षमता में मात्रा का ठहराव के लिए उपलब्ध तरीकों से अधिक है.
Abstract
Lipids biomolecules के प्रमुख वर्गों के एक और महत्वपूर्ण भूमिका झिल्ली गतिशीलता, ऊर्जा भंडारण खेलने, और संकेत
Protocol
सामग्री और विधियों
- खमीर उपभेदों और विकास की स्थिति
जंगली प्रकार तनाव BY4742 (leu2Δ0 MATα his3Δ1 lys2Δ0 ura3Δ0) अमीर YEPD माध्यम में हो गया था (1% खमीर निकालने, 2% peptone, 2% ग्लूकोज). कक्ष में 30 ° Erlenmeyer बोतल में 200 rpm पर "फ्लास्क मात्रा / मात्रा मध्यम" 5:01 के अनुपात में घूर्णी झटकों के साथ सी सुसंस्कृत थे. - लिपिड निकासी के लिए खमीर कोशिकाओं का भंडारण
- 5 मिनट के लिए 3000 XG पर कक्षों की एक 50 मिलीलीटर संस्कृति centrifugation द्वारा काटा गया था.
- ठंडे पानी के साथ दो बार धोया.
- 25 मिलीलीटर की बर्फ के ठंडे पानी में Resuspend गोली
- अपकेंद्रित्र में 5 मिनट के लिए 3000 XG पर गोली कोशिकाओं
- Eppendorf ट्यूब गोली और हस्तांतरण Resuspend
- Centrifugation द्वारा गोली, 2 मिनट के लिए 16,000 XG, -80 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोग जब तक सतह पर तैरनेवाला और फ्रीज हटाने. (हम isopropyl शराब के एक बीकर का उपयोग -80 फ्रीजर में रखा है, तरल नाइट्रोजन भी इस्तेमाल किया जा सकता है)
- अभिकर्मकों
बायोटेक ग्रेड क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल सिग्मा Aldrich से थे. फ्री फैटी एसिड और triacylglycerols Larodan (मैल्मो, स्वीडन) से खरीदे गए थे. Phospholipids के विभिन्न प्रजातियों सहित phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidic एसिड, और cardiolipins - अवंती ध्रुवीय लिपिड (सिलखड़ी, अल, संयुक्त राज्य अमेरिका) से प्राप्त किया गया. Teflon पंक्तिवाला टोपी के साथ उच्च गति गिलास अपकेंद्रित्र ट्यूबों फिशर से थे.
लिपिड निष्कर्षण
यह Bligh और 8 डायर द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के एक संशोधन है. निकाले लिपिड के साथ सभी जोड़तोड़ कांच pipettes या सीरिंज का उपयोग किया जाना चाहिए, प्लास्टिक के एक बड़े पृष्ठभूमि संकेत बना सकते हैं यदि वे क्लोरोफॉर्म के साथ संपर्क में आ जाएगा. MeOH - 3 कदम पर एच 2 हे और 2:2:1.8 क्लोरोफॉर्म के लिए - MeOH - एच 2 हे 7 कदम पर संरक्षित कर रहे हैं सटीक मात्रा लंबे समय के रूप में महत्वपूर्ण क्लोरोफॉर्म के लिए 1:2:0.8 के अनुपात के रूप में नहीं कर रहे हैं.
- ठंडा आसुत एच 2 ओ के 1.6 मिलीलीटर में जमे हुए कोशिकाओं Resuspend
- उच्च गति गिलास अपकेंद्रित्र ट्यूबों सेल निलंबन की 1.6 मिलीलीटर स्थानांतरण.
- क्लोरोफॉर्म और MeOH (1:2) मिश्रण और सेल निलंबन के लिए ग्लास मनकों की 0.8 मिलीलीटर के 6 मिलीलीटर जोड़ें.
- गिलास 1 मिनट के लिए दो बार मोतियों के साथ सेल निलंबन भंवर.
- क्लोरोफॉर्म के 2 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे मिश्रण.
- कभी कभी मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
- आसुत एच 2 हे 2 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे मिश्रण.
- कभी कभी मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
- कमरे के तापमान पर 3000 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- एक नया ग्लास उच्च गति अपकेंद्रित्र ट्यूब में पूरे तरल चरण लीजिए.
- 9 कदम से सेल छर्रों को क्लोरोफॉर्म की 3.2 मिलीलीटर जोड़ें.
- 1 मिनट के लिए दो बार भंवर.
- कमरे के तापमान पर 3000 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- तरल चरण के लिए 10 कदम से सतह पर तैरनेवाला जोड़ें.
- कमरे के तापमान पर 3000 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- ऊपरी चरण (जलीय) त्यागें और एक नया ग्लास उच्च गति अपकेंद्रित्र ट्यूब में कम चरण (जैविक) हस्तांतरण.
- कमरे के तापमान पर 3000 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- एक गिलास शीशी में पूरे सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण और नाइट्रोजन के तहत शुष्क.
- क्लोरोफॉर्म की 500 μl और दुकान में -20 डिग्री सेल्सियस पर लिपिड फिल्म भंग
Lipids के द्वारा मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण
क्लोरोफॉर्म (1:1) के साथ 0.1% (v / v) अमोनियम हाइड्रॉक्साइड - लिपिड मानकों के क्लोरोफॉर्म में शेयर मिश्रण तालिका 1, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से MeOH के एक शेयर समाधान के अनुसार पहले से तैयार किया जाना चाहिए.
- पहले इंजेक्शन के लिए, तालिका 1 में दी lipids की मानक मिश्रण के 10 μl के साथ एक नमूना के 10 μl गठबंधन. 200μL 01:01 क्लोरोफॉर्म: 0.1% 4 एनएच OH के साथ मेथनॉल.
- नमूना अनुपात करने के लिए मानक के रूप में की जरूरत बदला जा सकता है.
- एक Micromass Q-TOF 2 बड़े पैमाने पर नैनो electrospray μl 1 / मिनट की एक प्रवाह दर पर सोर्स ऑपरेटिंग साथ सुसज्जित स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग लिपिड संकल्प.
- सटीक साधन मापदंडों साधन से साधन के लिए अलग अलग होंगे. Micromass 2 क्यू-TOF (वाटर्स, Milford, MA, संयुक्त राज्य अमरीका) एक स्रोत नैनो electrospray के साथ सुसज्जित के लिए सेटिंग्स के लिए तालिका 2 देखें. हालांकि हम Q-TOF मास स्पेक्ट्रोमीटर के एक प्रकार के उच्च संकल्प का लाभ ले लिया है, यह एक अनिवार्य आवश्यकता नहीं है.
- अधिग्रहण के बाद जन स्पेक्ट्रा smoothed रहे हैं, पृष्ठभूमि और घटाया केंद्रित है, और फिर चोटी सूची Excel में निर्यात. प्रत्येक लिपिड वर्ग की चोटियों तो अपने आंतरिक मानक के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं. आवेदन के आधार पर, यह प्रदर्शन कर आगे प्रसंस्करण के बाद deisotoping और deconvolution जैसे आवश्यक हो सकता है.
तालिका 1. आंतरिक लिपिड मानकों, उनके सांद्रतामानक मिश्रण है, और उनके विश्लेषण के लिए एमएस मोड.
| लिपिड वर्ग | मानक श्रृंखला संरचना | मानक के द्रव्यमान | एकाग्रता (/ μg मिलीलीटर) | एमएस मोड |
| Phosphatidic एसिड | 14:00 / 14:00 | 591.40 | 100 | नकारात्मक |
| Phosphatidylethanolamine | 14:00 / 14:00 | 634.45 | 200 | नकारात्मक |
| Phosphatidylinositol | N / A | N / A | N / A | नकारात्मक |
| Phosphatidylserine | 14:00 / 14:00 | 622.37 | 40 | नकारात्मक |
| Cardiolipin | 4x14: 0 | 619.92 | 100 | नकारात्मक |
| फ्री फैटी एसिड | 19:00 | 297.28 | 100 | नकारात्मक |
| Phosphatidylcholine | 14:00 / 14:00 | 650.48 | 100 | सकारात्मक |
| Triacylglycerols | 13:0 / / 13:0 13:0 | 698.63 | 200 | सकारात्मक |
टेबल 2 Micromass 2 क्यू-TOF (वाटर्स, Milford, MA, संयुक्त राज्य अमरीका) के लिए साधन सेटिंग्स नैनो electrospray स्रोत के साथ सुसज्जित है.
| प्रवाह दर | कोन वोल्टेज | केशिका वोल्टेज | टकराव की गैस | |
| सकारात्मक मोड | 1μl/min | -28 V | 3.0 केवी | 10 |
| नकारात्मक मोड | 1μl/min | 30 v | -3.2 के.वी. | 10 |
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Discussion
इस विधि खमीर lipidome के आसानी से उपलब्ध सस्ती सामग्री का उपयोग तेजी से मात्रात्मक निर्धारण के लिए सक्षम बनाता है. विधि लिपिड diacylglycerols, ergosterols और ergosteryl एस्टर के अपवाद के साथ खमीर कोशिकाओं में पाया प्रजातियों में से अधिकांश की पहचान की अनुमति देता है, हालांकि इन लिपिड लिथियम हीड्राकसीड के साथ अमोनियम हाइड्रॉक्साइड की जगह से पहचाना जा सकता है. वर्णित विधि μg / मिलीलीटर के रूप में कम के रूप में सांद्रता में एकाग्रता linearity परिमाण के 2 से 3 आदेश (लिपिड प्रजातियों पर निर्भर करता है) से अधिक प्रसार के साथ लिपिड पहचान और मात्रा का ठहराव, सक्षम बनाता है. हालांकि phosphatidylinositol के लिए उपयुक्त मानकों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं, इस फॉस्फोलिपिड के विभिन्न आणविक रूपों अन्य फॉस्फोलिपिड प्रजातियों के लिए मानकों का उपयोग मूल्यांकन किया जा सकता है.
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Acknowledgments
हम बहुमूल्य सलाह, चर्चा, और तकनीकी सहायता के लिए Alain Tessier के लिए आभारी हैं. हम Concordia विश्वविद्यालय में मास स्पेक्ट्रोमेट्री की उत्कृष्ट सेवाओं के लिए जैविक अनुप्रयोगों के लिए केंद्र स्वीकार करते हैं. यह काम CIHR और कनाडा के NSERC से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. VIT एक CIHR नई अन्वेषक और जीनोमिक्स में Concordia विश्वविद्यालय अनुसंधान चेयर, सेल बायोलॉजी और एजिंग है.
References
- Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism. Cell. 134, 933-944 (2008).
- Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane. J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).
- Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane. J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).
- Russell, S. J., Kahn, C. R. Endocrine regulation of ageing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).
- Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).
- Brü, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &, F. T., Lehmann, W. D. Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).
- Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane. J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
