Summary
Мы описываем новый количественный метод lipidomics для выявления многочисленных видов липидов в дрожжах использованием обследований сканирования электрораспылением ионизации масс-спектрометрии (ESI / MS). Этот метод в настоящее время превышает методов идентификации и количественного определения липидного в способности для решения самых разных молекулярных форм липидов, чувствительность и скорость.
Abstract
Липиды являются одним из основных классов биомолекул и играют важную роль мембраны динамика, накопление энергии, и сигнализация
Protocol
Материалы и методы
- Штаммов дрожжей и условий роста
Штамма дикого типа BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) был выращен в богатой среде YEPD (1% дрожжевой экстракт, пептон 2%, 2% глюкозы). Клетки культивировали при 30 ° С с вращательными встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту в колбах Эрленмейера на "колбе объем / средний объем" отношением 5:1. - Хранение дрожжевых клеток для экстракции липидов
- 50 мл культуры клеток собирают центрифугированием при 3000 мкг в течение 5 минут.
- Промывают два раза с холодной водой.
- Ресуспендируют гранул в 25 мл ледяной воды
- Гранул клеток в центрифуге при 3000 мкг в течение 5 минут
- Ресуспендируют гранул и трансфер в Эппендорф трубки
- Гранул путем центрифугирования, 16 000 мкг в течение 2 минут, удалите супернатант и заморозить при -80 ° C до использования. (Мы используем стакан изопропиловый спирт хранится в морозильной камере -80, жидкий азот также может быть использован)
- Реагенты
Biotech класса хлороформа и метанола от Sigma-Aldrich. Свободные жирные кислоты и триглицериды были приобретены у Larodan (Мальме, Швеция). Различные виды фосфолипидов - в том числе фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерина, фосфатидная кислоты и cardiolipins - были получены из Avanti Полярный липидов (Alabaster, Алабама, США). Высокоскоростной стекла пробирок с тефлоновым выстроились шапки из Фишер.
Липидный добычи
Это изменение протокола описывается Блая и Дайера 8. Все манипуляции с извлекаемыми липидов должно быть сделано с помощью стеклянной пипетки или шприцы; пластмасс создаст большие фонового сигнала, если они вступают в контакт с хлороформом. Точные объемы не являются критическими тех пор, пока отношения 1:2:0.8 для хлороформ - метанол - H 2 O на шаге 3 и 2:2:1.8 для хлороформ - метанол - H 2 O в шаге 7 сохраняются.
- Ресуспендируют замороженных клеток в 1,6 мл ледяной дистиллированной H 2 O.
- Передача 1,6 мл клеточной суспензии к высокоскоростному стеклянные трубки центрифуги.
- Добавить 6 мл хлороформа и метанола (1:2) смеси и 0,8 мл стеклянных шариков для клеточной суспензии.
- Vortex клеточной суспензии со стеклянными шариками два раза в течение 1 мин.
- Добавьте 2 мл хлороформа и аккуратно перемешать.
- Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре с редкими смешивания.
- Добавьте 2 мл дистиллированной H 2 O и аккуратно перемешать.
- Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре с редкими смешивания.
- Центрифуга в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
- Сбор всей жидкой фазы в новой высокоскоростной центрифуге трубки стекла.
- Добавить 3,2 мл хлороформа в камеру гранулы из шагу 9.
- Vortex два раза в течение 1 мин.
- Центрифуга в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
- Добавить супернатант в жидкую фазу, начиная с шага 10.
- Центрифуга в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
- Откажитесь от верхней (водный) фазы и передачу ниже (органические) фазы в новой высокоскоростной центрифуге трубки стекла.
- Центрифуга в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
- Передача всей супернатант в стеклянный флакон и сухой атмосфере азота.
- Растворите липидной пленки в 500 мкл хлороформа и хранить при температуре -20 ° C.
Анализ липидов методом масс-спектрометрии
Акции смесь липидных стандартов в хлороформе должны быть подготовлены заранее, так как в таблице 1, а также исходный раствор метанола - хлороформ (1:1) с 0,1% (об. / об) гидроксида аммония.
- До инъекции, объединить 10 мкл образца 10 мкл стандартной смеси липидов представлены в таблице 1. В 200 мкл 1:1, хлороформ: метанол с 0,1% NH 4 OH.
- Стандарт образца соотношение может быть изменен по мере необходимости.
- Решение липидов использованием Micromass Q-TOF масс-спектрометр 2 оснащены нано-электрораспылением источник, работающих на скорости потока 1 мкл / мин.
- Точные параметры инструмента будет варьироваться от инструмента к инструменту. См. Таблицу 2 для параметров Micromass Q-ToF 2 (Уотерс, Милфорд, Массачусетс, США), оснащенных нано-электрораспылением источник. Хотя мы и воспользовались высоким разрешением Q-TOF тип масс-спектрометра, это не обязательное требование.
- После приобретения масс-спектрах сглаживаются, фон вычитается и по центру, а затем пик список экспортируется в Excel. Пиков каждого липидного класса, то нормализованные к их внутренним стандартам. В зависимости от приложения, оно может быть необходимо делать выполнения дальнейшей пост-обработки, такие как deisotoping и деконволюции.
Таблица 1. Внутренние стандарты липидов, их концентрация встандартные смеси, а режим MS для их анализа.
Липидный класса | Стандартный состав цепи | Масса стандартной | Концентрация (мкг / мл) | MS режиме |
Фосфатидных кислоты | 14:0 / 14:0 | 591,40 | 100 | Отрицательный |
Фосфатидилэтаноламина | 14:0 / 14:0 | 634,45 | 200 | Отрицательный |
Фосфатидилинозитол | N / A | N / A | N / A | Отрицательный |
Фосфатидилсерин | 14:0 / 14:0 | 622,37 | 40 | Отрицательный |
Кардиолипин | 4x14: 0 | 619,92 | 100 | Отрицательный |
Свободные жирные кислоты | 19:00 | 297,28 | 100 | Отрицательный |
Фосфатидилхолин | 14:0 / 14:0 | 650,48 | 100 | Положительный |
Триглицериды | 13:0 / 13:0 / 13:0 | 698,63 | 200 | Положительный |
Таблица 2. Инструмент настройки для Micromass Q-ToF 2 (Уотерс, Милфорд, Массачусетс, США), оснащенных нано-электрораспылением источник.
Расход | Конус напряжения | Капиллярная напряжения | Столкновение газа | |
Положительные режиме | 1μl/min | -28 V | 3,0 кВ | 10 |
Отрицательные режиме | 1μl/min | 30 В | -3,2 КВ | 10 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод позволяет быстрое количественной оценки дрожжей lipidome с помощью легко доступных, недорогих материалов. Метод позволяет идентифицировать большинство из липидных видов, обитающих в дрожжевые клетки, за исключением diacylglycerols, ergosterols и ergosteryl эфиры, хотя эти липиды могут быть идентифицированы по замене гидроксида аммония с гидроксидом лития. Описанный метод позволяет идентифицировать липидов и количественная на таких низких концентрациях, как мкг / мл, с концентрацией линейности распространяется свыше 2 до 3 порядков (в зависимости от липидного видов). Хотя соответствующие стандарты для фосфатидилинозитол не в продаже, различных молекулярных форм этого фосфолипида можно оценить, используя стандарты для других видов фосфолипидов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарны Ален Tessier за ценные советы, обсуждения и техническую поддержку. Мы признаем, центр биологических Применение масс-спектрометрии в Конкордии университета за выдающиеся заслуги. Эта работа была поддержана грантами CIHR и NSERC Канады. VIT является следователь CIHR Новые и Concordia University исследований кафедры геномики, клеточной биологии и старения.
References
- Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism. Cell. 134, 933-944 (2008).
- Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane. J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).
- Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane. J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).
- Russell, S. J., Kahn, C. R.
Endocrine regulation of ageing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007). - Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).
- Brü, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &, F. T., Lehmann, W. D. Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).
- Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane. J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).