Summary
우리는 조사 스캔 전기 분무 이온화 질량 분광법 (ESI / MS)를 사용하여 효모의 수많은 지질 수종을 식별하기위한 새로운 양적 lipidomics 방법을 설명합니다. 이 방법은 현재 lipids, 감도 및 속도의 다양한 분자 형태를 해결하는 능력 지질 식별 및 부량 사용할 방법을 초과했습니다.
Abstract
Lipids은 biomolecules의 주요 클래스 중 하나이며 중요한 역할 막 역학, 에너지 저장을 재생하고, 신호
Protocol
재료 및 방법
- 효모 변종과 성장 조건
야생 형 변형 BY4742는 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) (1 % 효모 추출물, 펩톤 2 %, 2 % 포도당) 풍부한 YEPD 매체에서 재배되었다. 전지는 30 ° C 회전이 5시 1분의 "플라스크 볼륨 / 볼륨 매체"비율 Erlenmeyer flasks의 200 rpm으로 잡고 교양되었습니다. - 지질 추출을위한 효모 세포의 스토리지
- 세포의 50 ML 문화 5 분 동안 3,000 XG에서 원심 분리에 의해 수확했다.
- 찬물로 두 번 씻어.
- 25 ML 얼음 냉수에 Resuspend 펠릿
- 5 분 3,000 XG에 원심 분리기의 펠릿 세포
- eppendorf 튜브에 펠렛 및 전송을 Resuspend
- 원심 분리에 의해 펠렛, 2 분 16,000 XG, 사용할 때까지 -80 ° C에서 뜨는 및 동결을 제거하십시오. (우리는 이소 프로필 알코올의 비이커를 사용, 액체 질소도 사용할 수있는 -80 냉동실에 보관)
- 시약
생명 공학 등급 클로로포름과 메탄올은 시그마 - 알드리치에서 있었다. 자유 지방산과 triacylglycerols는 Larodan (말뫼, 스웨덴)에서 구입했다. phospholipids의 다양한 종류 - phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidic 산성 및 cardiolipins 포함하여 - 아반티 북극 지질 (엘라 베스터, AL, 미국)에서 얻은되었습니다. 테플론 늘어선 모자와 고속 유리 원심 분리기 튜브는 피셔에서 있었다.
지질 추출
이것은 블라과 다이어 8 시까지 설명한 프로토콜의 수정입니다. 추출 lipids로 모든 조작은 유리 pipettes이나 주사기를 사용하여 완료해야합니다, 그들은 클로로포름과 접촉하면 플라스틱이 큰 배경 신호를 생성합니다. MeOH - - 클로로포름에 대한 H 2 단계 3 O 및 2:2:1.8 - MeOH - H 2 O 7 단계에서 보존 아르 클로로포름에 대한 1:2:0.8의 비율이로 정확한 볼륨은 한 중요하지 않습니다.
- 얼음처럼 차가운 소주 H 2 O.의 1.6 ML에 냉동 세포를 Resuspend
- 고속 유리 원심 튜브에 세포 현탁액의 1.6 ML을 전송합니다.
- 클로로포름과 MeOH (1시 2분) 믹스와 세포 현탁액을 유리 구슬의 0.8 ML 6 ML을 추가합니다.
- 유리 구슬 1 분 두 배와 함께 소용돌이 세포 현탁액을.
- 클로로포름 2 ML을 추가하고 부드럽게 섞는다.
- 가끔 혼합과 함께 실온에서 5 분 알을 품다.
- 소주 H 2 O 2 ML을 추가하고 부드럽게 섞는다.
- 가끔 혼합과 함께 실온에서 5 분 알을 품다.
- 상온에서 3,000 XG에서 5 분 원심 분리기.
- 새로운 고속 유리 원심 튜브에 전체 액상를 수집합니다.
- 9 단계에서 세포 펠렛을 클로로포름 3.2 ML를 추가합니다.
- 1 분 와동을 차례로 두 번.
- 상온에서 3,000 XG에서 5 분 원심 분리기.
- 10 단계에서 액상으로 뜨는을 추가합니다.
- 상온에서 3,000 XG에서 5 분 원심 분리기.
- 상단 (수성) 단계를 폐기하고 새로운 고속 유리 원심 관에 낮은 (유기) 단계를 전송합니다.
- 상온에서 3,000 XG에서 5 분 원심 분리기.
- 유리관에 전체 표면에 뜨는를 전송하고 질소하에 건조.
- -20 ° C. 500 클로로포름의 μl와 저장소에있는 지질 필름을 디졸브
질량 분석법에 의해 lipids 분석
0.1 %로 클로로포름 (1:1) (V / V) 암모늄 수산화 - 클로로포름의 지질 기준 주식 혼합은 표 1과 같은뿐만 아니라 MeOH의 재고 솔루션마다 미리 준비를해야합니다.
- 이전 주사로, 표 1에서 제공하는 lipids의 표준 혼합 10 μl와 샘플 10 μl을 결합. 1시 1분 클로로포름의 200μL의 경우 : 0.1 % NH 4 OH와 메탄올.
- 샘플 비율 표준은 필요에 따라 변경할 수 있습니다.
- 1 μl / 분 유량에서 나노 전기 분무 소스 운영 갖춘 Micromass Q - TOF이 질량 분석기를 사용하여 lipids를 해결합니다.
- 정확한 악기 매개 변수는 악기에서 악기로 달라질 수 있습니다. 나노 전기 분무 소스 갖춘 Micromass Q - ToF 2 (워터스, 밀퍼드, MA, 미국)의 설정 표 2를 참조하십시오. 우리는 질량 분석계의 Q - TOF 유형의 고해상도의 이점을 촬영했지만, 그것은 필수 요구하지 않습니다.
- 취득 후 질량 스펙트럼은 smoothed 있으며, 배경 빼는와 중심 후 정상 목록은 Excel로 내보 냈습니다. 각 지질 클래스의 봉우리는 다음의 내부 기준에 정상화됩니다. 응용 프로그램에 따라, 그것은 deisotoping 및 deconvolution 등 추가로 후처리 등을 수행 할 필요가있을 수 있습니다.
표 1. 내부 지질 기준, 그들의 농도에표준 믹스, 그들의 분석을위한 MS 모드.
| 지질 클래스 | 표준 체인 구성 | 표준 질량 | 농도 (μg / ML) | MS 모드 |
| Phosphatidic 수 소산 | 14시 / 14시 | 591.40 | 100 | 부정 |
| Phosphatidylethanolamine | 14시 / 14시 | 634.45 | 200 | 부정 |
| Phosphatidylinositol | N / A | N / A | N / A | 부정 |
| Phosphatidylserine | 14시 / 14시 | 622.37 | 40 | 부정 |
| Cardiolipin | 4x14 : 0 | 619.92 | 100 | 부정 |
| 자유 지방산 | 19시 | 297.28 | 100 | 부정 |
| Phosphatidylcholine | 14시 / 14시 | 650.48 | 100 | 긍정적인 |
| Triacylglycerols | 13시 / 13시 / 13시 | 698.63 | 200 | 긍정적인 |
표 2. Micromass Q - ToF 2 (워터스, 밀퍼드, MA, 미국)의 인스 트루먼트 설정은 나노 전기 분무 소스와 함께 갖추고 있습니다.
| 유량 | 콘 전압 | 모세관 전압 | 충돌 가스 | |
| 긍정 모드 | 1μl/min | -28 V | 3.0 KV | 10 |
| 부정 모드 | 1μl/min | 30 V | -3.2 KV | 10 |
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Discussion
이 방법은 쉽게 사용할 수, 저렴한 재료를 사용하여 효모 lipidome의 급속한 양적 평가를 수 있습니다. 이러한 lipids가 수산화 리튬과 수산화 암모늄을 대체하여 확인할 수 있지만이 방법은, diacylglycerols, ergosterols 및 ergosteryl 에스테르를 제외한 효모 세포에있는 지질의 종류 대부분의 신분증을 수 있습니다. 설명한 방법은 농도 선형성은 진도 2 ~ 3 주문 (지질 종류에 따라 다름) 이상의 확산과 함께 μg / ML로 낮은 농도에서 지질 식별 및 부량 수 있습니다. phosphatidylinositol에 적합한 기준이 상업적으로 사용할 수 없습니다 있지만,이 인지질의 서로 다른 분자 형태는 다른 인지질 수종에 대한 표준을 사용하여 평가하실 수 있습니다.
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Acknowledgments
우리는 귀중한 조언, 토론 및 기술 지원 알랭 테시어에 감사하고 있습니다. 우리는 뛰어난 서비스 콩코디아 대학에서 질량 분석법의 생물 학적 응용 프로그램을위한 센터를 인정합니다. 이 작품은 CIHR과 캐나다의 NSERC에서 보조금에 의해 지원되었다. VIT는 CIHR 새로운 인베스티게이터와 게놈의 콩코디아 대학 연구 위원장, 세포 생물학 및 노화입니다.
References
- Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism. Cell. 134, 933-944 (2008).
- Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane. J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).
- Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane. J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).
- Russell, S. J., Kahn, C. R. Endocrine regulation of ageing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).
- Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).
- Brü, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &, F. T., Lehmann, W. D. Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).
- Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane. J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
