Summary
在FGF - 2的存在培养的大鼠晶状体上皮细胞的中部地区的外植体分化同步。这种文化免疫荧光显微镜，可以提供有关新的信息与终末分化相关的基因表达和信号事件。
Abstract
目镜的前表面覆盖由单层上皮细胞，在一个环形睫状体区底层增殖。司以下的，这些细胞迁移后方，FGF从视网膜扩散诱导它们分化成一个拉长的镜头纤维细胞，撰写大部分的镜头后的数组。晶状体上皮细胞分化成晶状体纤维可在体外诱导培养外植体的中部地区前上皮细胞中FGF - 2的存在。植准备，消除眼睛的镜头和把握晶状体囊解剖镊子后从新生大鼠镜头。后囊，然后轻轻地撕开，并压成一个组织培养皿塑料底。用手术刀将被删除外植体周边地区和中部地区，然后培养在FGF - 2 100ng/ml只要2-3周的存在，取决于要研究的参数。由于培养外植体的上皮细胞分化近似同步信号和基因表达的时间超过几天到几周内，当然可以决定使用分子，生化和药理技术。免疫荧光显微镜是一个功能强大的辅助手段，这些方法，因为它表明利益的蛋白质的亚细胞定位，并能够揭示信号转导通路的实验操作的生理后果。
Protocol
第1部分：去除镜片
材料与试剂：
- 微解剖剪刀，弯曲，生硬的提示，（如as.RS - 5983，Roboz手术器械有限责任公司，马里兰州盖瑟斯堡）;微解剖镊子，弯尖（如Roboz＃RS5137）。
- 悬浮介质：中等199含0.1％牛血清白蛋白，100单位/ ml青霉素，100μg/ml链霉素，2.5微克/毫升两性霉素B试剂可以从Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA。
程序：
- 安乐死新生大鼠（年龄在2-4天），按照卫生，马里兰州贝塞斯达的国立研究所提供的指引。
- 卸下眼睑手术剪刀。眼圈两侧弯曲镊子轻轻按下，迫使眼睛向外凸出。后路侧眼用剪刀做一个小切口。按下镊子与反对方眼对面的切口，然后被强迫的镜头和一个附加玻璃体少量通过破裂，使镜头被拾起弯曲镊子。应采取不打破晶状体囊。
- 使用弯曲的镊子镜片转移到60毫米塑料组织培养皿中含有5毫升温暖，无菌的悬浮介质。
第2部分：外植体的显微切割
材料与试剂：
- 微解剖镊子，0.1毫米的提示，（如RS - 4976 Roboz）。我们使用，因为尖端的灵活性Dumostar合金，但也是可以接受的其他合金钢的。提示厚度小于0.1mm的镊子是不建议，因为他们往往在此过程中折断或弯曲。
- 悬浮介质（见第1部分）
- Unsupplemented火腿的F12中等或中等199（Invitrogen公司，Carlsburg，CA）
程序：
- 应进行下列步骤，在一个干净的草案，免费使用无菌解剖工具和无菌介质环境。
- 使用立体解剖显微镜，任何坚持组织镜片清洁与0.1毫米尖镊子，将它们传输到第二个60毫米培养皿中含有5毫升无菌悬浮介质（这一步，有利于减少污染）。用镊子，将所需数量的镜头，一个35mm的培养皿中含有5毫升无菌，unsupplemented中等。 （我们经常使用这一步火腿的F12（Invitrogen公司），因为在较低的染料浓度使清扫容易，但是，中等199是还可以接受任何抗生素或其它添加内容是在这一步需要。。）由于许多为12外植体可以被制成在一盘这种规模的中心。然而，一个35毫米的菜应使用，即使少植，解剖工具，因为不能在一个较小的菜很容易被操纵。转让的菜，含有其余的镜头一个组织文化的孵化器，在37 ° C直到他们需要的。
- 确定的镜头后的一面。认识到这一点的方法有很多：1）后比前，这是略扁平的圆; 2）新生鼠镜头形成冷白内障，因为他们凉在清扫室温。如果冷白内障还没有完全填补镜头，后一边是从不透明区域最远的一侧。如果不透明度，填补了镜头，气候变暖的菜到37 ° C的几分钟内将扭转这种局面。后侧面可以被认定为冷却后的白内障改革。 3） 白膜vasculosa晶状体的痕迹，可能后可见。 4）后缝合后可见。正确识别后一边是必不可少的，因为这是将胶囊打开。开幕式上的镜头前侧撕裂的上皮细胞。
- 一旦后已经确定，把它向上和把握在左镊子镜头（右手工人）。然后捏住镊子产生一个小的折叠后囊。
- 按住后囊，把握正确的镊子左镊子胶囊倍，拉两对镊子，在相反的方向，使小囊中撕裂。
- 在抓镊子缩回胶囊的边缘，将它拉向下，首先在一边，然后，另一方面，它压入菜用的镊子的塑料。重复了几次，围绕赤道的镜头移动，直到胶囊牢固地附着在板材多点。在左镊子胶囊，轻轻摇动纤维质量与正确的镊子，打破附着在晶状体赤道之间的纤维细胞和上皮细胞。然后推动纤维质量，滚动胶囊/上皮细胞，这仍然是底部菜。继续这个过程中，在盘子里的所有镜头。删除和丢弃的纤维群众（或将它们保存为其他研究的晶状体蛋白源冻结）。
第3部分：中央外植体的显微切割和文化
材料与试剂：
- 一次性无菌手术刀，15号刀片，（手术有限公司辛辛那提，俄亥俄州辛辛那提）
- 无菌磷酸盐缓冲生理盐水与钙和镁（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）
- 培养基：含100ng/ml FGF - 2（Sigma - Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州）的悬浮介质。
程序：
- 用消毒的手术刀，修剪掉周边上皮（PE），其中包含细胞分化的早期阶段（图1A），离开中央广场约2.0毫米，中央上皮细胞组成的一个侧面，（CE认证）（图1B）。
- 传输的中央植菜含有一个生物安全柜。无菌PBS含有钙和镁的一次新鲜，平衡（37 ° C，5％CO 2）悬浮介质1毫升清洗3次。这些清洗污染的可能性大大降低。
- 添加培养基2ML，诱导分化 1，并将其放置在饱和湿度，组织培养孵化器的外植体在37 ° C，5％的CO 2。文化时期可能只要短短几个小时，或延长，只要两至三个星期，根据正在研究的参数。中期应改为每两至三天。
第4部分：外植体的收获与分化相关的事件的分析
1。分析蛋白质或RNA的收获植
材料：
- Microdissecting镊子
- SDS裂解液，或RNA后
程序：
- 在潜伏期末，去除培养基。
- 使用立体解剖显微镜，轻轻地松开每个外植体的边缘。
- 用镊子提起每个外植体，并将其转移到100μLSDS裂解液（蛋白质分析）或RNA后（RNA分析）包含一管。刺激的解决方案中的镊子尖端，以确保外植体不沾镊子。
2。免疫收获植
材料与试剂：
- 磷酸盐缓冲生理盐水与钙和镁（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）
- 磷酸盐缓冲液（无钙和镁的）（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA）
- 4％多聚甲醛（波士顿生物制品，马萨诸塞州伍斯特市）
- Microdissecting镊子
- 疏水标记笔
- 显微镜幻灯片
- 0.25％的Triton X - 100的磷酸盐缓冲液。
程序：
- PBS中含有钙，镁等，简单地冲洗植。
- 加入4％多聚甲醛在室温下30分钟，修复组织。
- 取出固定液，用磷酸盐缓冲液取代。固定植变得有点僵硬，让他们解除和免疫转移到玻片。
- 将幻灯片上的位置，以帮助组织和防止卷曲的小下降的PBS（不包括钙和镁的）。使用microdissecting镊子，电梯外植体，并把它插入到幻灯片上的下降。不接触外植体，小心地取出一张纸烛芯的液体外植体上的玻璃压平，让组织在空气干燥，在室温下3〜5分钟。
图1 A的周边上皮细胞表达分化的特定蛋白质。显示外植体为N - cadherin的免疫染色后立即显微切割。表达被认为是在一个乐队在周边上皮细胞，表明细胞在这一地区已开始分化。B.，周边上皮可削去去除细胞表达N - cadherin的和其他分化的特定蛋白质。红色环代表表达N - cadherin的，而灰色概述小方代表象限面板1A所示上皮细胞的位置。四个手术刀切割周边上皮可去除，留下了中央广场，仅包含尚未开始分化的细胞。
Discussion
大鼠晶状体植体系统，已成功地用于由一个实验室，研究终端晶状体上皮细胞分化为晶状体纤维 21,3,4,5 。当暴露在100ng/ml FGF - 2的外植体将开始显示在几分钟之内6信号的变化，在形态和基因表达在 3,4,5几天连续出现的变化。如果护理是采取措施防止污染的文化仍然可行2-3周。
在本议定书中所描述的中央植学习分化相关的事件顺序特别有用，因为它们包含几个如果任何细胞表达FGF - 2之前的分化标记添加1,5。细胞分化同步，作为一个队列中，使其能够按照信令和分化相关的转录事件的时间当然。培养时间长短不同外植体，从而提供准确的时间信息的顺序事件。特异性抑制剂可添加到培养基中，以确定有关的信号通路。可用于植SDS凝胶电泳和免疫印迹分析蛋白表达或以特定的mRNA经RT - PCR分析的表达。蛋白质产量从20-50微克/外植体和RNA产量的范围大约是200 - 600毫微克/外植体，取决于文化时期的长度。我们一般5-6个菜植几个检测提供足够的蛋白质或RNA。从外植体的RNA也可以用来准备评估，通过基因芯片分析，它可以识别新基因，可能是分化的关键基因表达的cDNA。植也可以转。虽然转染效率普遍偏低，这是足够的化验报告基因4; 7; 8。免疫荧光显微镜外植体提供了一个有用的辅助生化方法确定利益的蛋白质的亚细胞定位。因此，编制和大鼠晶状体植的文化提供了一个功能强大的系统研究在哺乳动物终端镜头分化，可以补充体内的技术，如转基因和基因敲除小鼠的一代，的。
Acknowledgments
晶状体上皮植的准备工作已经改编自起源于实验室的博士约翰麦卡沃伊9的方法。这项工作是由美国国家眼科研究所，院内研究计划Z01 - EY000238 - 22
References
- McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration. Development. 107 (2), 221-228 (1989).
- Campbell, M. T., McAvoy, J. W. Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium. Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).
- Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF). Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).
- Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling. J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).
- Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation. Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).
- Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling. Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).
- Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene. Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).
- Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin. The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).
- McAvoy, J. W., T, V. Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants. Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).
