Summary
चूहा लेंस epithelia के मध्य क्षेत्र के Explants synchronously अंतर जब FGF-2 की उपस्थिति में संवर्धित. ऐसी संस्कृतियों के immunofluorescence माइक्रोस्कोपी उपन्यास जीन अभिव्यक्ति और संकेत टर्मिनल भेदभाव के साथ जुड़े घटनाओं के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं.
Abstract
नेत्र लेंस के पूर्वकाल सतह उपकला कोशिकाओं है, जो एक कुंडलाकार सिलिअरी शरीर अंतर्निहित क्षेत्र में पैदा की एक monolayer द्वारा कवर किया जाता है. विभाजन के बाद, इन कोशिकाओं को पीछे विस्थापित, जहां रेटिना से diffusing FGF उन्हें लम्बी लेंस फाइबर कोशिकाओं है, जो लेंस की थोक की रचना के पीछे सरणी में अंतर लाती है. लेंस तंतुओं में लेंस उपकला कोशिकाओं के भेदभाव FGF-2 की उपस्थिति में पूर्वकाल उपकला के मध्य क्षेत्र के संवर्धन explants द्वारा इन विट्रो में प्रेरित किया जा सकता है. Explants नवजात चूहों के लेंस से आँख से लेंस को हटाने और विदारक चिमटी के साथ पीछे की ओर पर लेंस कैप्सूल लोभी द्वारा तैयार कर रहे हैं. पीछे कैप्सूल फिर धीरे से खुला फाड़ा और एक टिशू कल्चर पकवान की प्लास्टिक नीचे में नीचे दबाया. explant के परिधीय क्षेत्रों में एक स्केलपेल के साथ हटा रहे हैं और केंद्रीय क्षेत्र तो 100ng/ml FGF-2 के रूप में लंबे समय के रूप में 2-3 सप्ताह के लिए की उपस्थिति में संवर्धित है, अध्ययन किया जा मापदंडों पर निर्भर करता है. चूंकि सुसंस्कृत explants में उपकला कोशिकाओं सप्ताह के लिए दिनों की अवधि में लगभग synchrony में अंतर, संकेतन और जीन अभिव्यक्ति के समय कोर्स आणविक, जैव रासायनिक और औषधीय तकनीक का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है है. Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी इन तरीकों के लिए एक शक्तिशाली सहायक के रूप में यह ब्याज की प्रोटीन का subcellular स्थानीयकरण दर्शाता है और संकेत दे रास्ते के प्रयोगात्मक अभिव्यक्ती की शारीरिक परिणाम प्रकट कर सकते हैं.
Protocol
भाग 1: लेंस का हटाया
सामग्री और अभिकर्मकों:
- माइक्रो विदारक कैंची, घुमावदार, कुंद सुझावों, (जैसे as.RS-5983, Roboz सर्जिकल उपकरण कं, इंक, Gaithersburg, एमडी), माइक्रो विदारक चिमटी, घुमावदार टिप (जैसे RS5137 # Roboz).
- सस्पेंशन मध्यम: 199 मध्यम 0.1 गोजातीय सीरम albumin, 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन%, 100μg/ml स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2.5 μg / एमएल Amphotericin बी अभिकर्मकों युक्त Invitrogen, Carlsbad, CA से उपलब्ध हैं.
प्रक्रिया:
- स्वास्थ्य, Bethesda, एमडी के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा उपलब्ध कराए गए दिशा निर्देशों के अनुसार में नवजात चूहों (2-4 दिन आयु वर्ग) euthanize.
- शल्य कैंची के साथ पलकें निकालें. थैली के विपरीत पक्षों पर घुमावदार चिमटी के साथ धीरे प्रेस उभाड़ना करने के लिए आँख जावक मजबूर है. कैंची के साथ आँख के पीछे तरफ एक छोटा सा चीरा बनाओ. चीरा विपरीत आंख के पक्ष के खिलाफ चिमटी के साथ दबाने से, लेंस और संलग्न कांच का शरीर की एक छोटी राशि तो टूटना के माध्यम से बाहर कर सकते हैं मजबूर हो, अनुमति लेंस घुमावदार चिमटी के साथ उठाया जाएगा. देखभाल करने के लिए लेंस कैप्सूल नहीं तोड़ लिया जाना चाहिए.
- घुमावदार चिमटी का प्रयोग के लिए एक 60mm प्लास्टिक ऊतक संस्कृति 5ml गर्म, बाँझ निलंबन मध्यम युक्त पकवान लेंस हस्तांतरण.
भाग 2: explants के Microdissection
सामग्री और अभिकर्मकों:
- माइक्रो विदारक चिमटी, 0.1 मिमी, सुझावों (जैसे रु 4976 Roboz). हम टिप के लचीलेपन की वजह से Dumostar मिश्र धातु का उपयोग करते हैं, लेकिन अन्य इस्पात मिश्र भी स्वीकार्य हैं. 0.1mm से पतले सुझावों के साथ चिमटी की सिफारिश नहीं है के रूप में वे को तोड़ने के लिए या इस प्रक्रिया के दौरान मोड़ देते हैं कर रहे हैं.
- सस्पेंशन मध्यम (भाग 1 देखें)
- हाम F12 मध्यम या 199 मध्यम (Invitrogen, Carlsburg, सीए) Unsupplemented
प्रक्रिया:
- निम्नलिखित चरणों का एक साफ, मसौदा मुक्त बाँझ विदारक उपकरण और बाँझ माध्यम का उपयोग करते हुए पर्यावरण में बाहर किया जाना चाहिए.
- एक स्टीरियो - विदारक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, 0.1 मिमी टिप चिमटी के साथ किसी भी पालन ऊतक के लेंस को साफ करने के लिए और उन्हें एक दूसरे 60mm संस्कृति 5ml बाँझ निलंबन मध्यम (इस कदम के लिए संदूषण को कम करने में मदद करता है) युक्त पकवान को हस्तांतरण. चिमटी के साथ, एक 35 मिमी संस्कृति 5ml बाँझ, unsupplemented मध्यम युक्त डिश के लिए लेंस की वांछित संख्या हस्तांतरण. (अक्सर हम इस कदम के लिए हाम F12 (Invitrogen) का उपयोग करें, क्योंकि कम डाई एकाग्रता विच्छेदन आसान बनाता है, तथापि, 199 मध्यम भी स्वीकार्य नहीं एंटीबायोटिक दवाओं या अन्य परिवर्धन के इस कदम के दौरान की जरूरत है.) के रूप में कई के रूप में 12 explants बनाया जा सकता है एक डिश इस आकार के केन्द्र में है. हालांकि, एक 35 मिमी पकवान भले ही कम explants करने के लिए बनाया है, क्योंकि विदारक उपकरण आसानी से एक छोटे पकवान में छेड़छाड़ नहीं किया जा सकता है इस्तेमाल किया जाना चाहिए. 37 पर एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर शेष लेंस युक्त पकवान स्थानांतरण ° सी जब तक वे की जरूरत है.
- लेंस के पीछे की ओर पहचानें. इस पहचान के लिए कई तरीके हैं: 1) पीछे पूर्वकाल, जो थोड़ा चपटा है की तुलना में राउंडर है;) 2 नवजात चूहे लेंस ठंड मोतियाबिंद फार्म के रूप में वे विच्छेदन के दौरान कमरे के तापमान शांत करने के लिए. यदि ठंड मोतियाबिंद लेंस पूरी तरह से नहीं भरी है, पीछे की ओर पक्ष अपारदर्शी क्षेत्र से दूर है. यदि अस्पष्टता लेंस भरी है, 37 के लिए पकवान वार्मिंग डिग्री सेल्सियस यह एक कुछ मिनट के लिए रिवर्स जाएगा. पीछे पक्ष ठंडा पर मोतियाबिंद सुधारों के रूप में पहचाना जा सकता है है. 3) आवरक झिल्ली vasculosa lentis के अवशेष पीछे तरफ दिखाई हो सकता है. 4) पीछे सीवन पीछे तरफ दिखाई हो सकता है. पीछे की ओर सही ढंग से पहचान आवश्यक है, के बाद से इस है जहां कैप्सूल खोला जाएगा. पूर्वकाल तरफ लेंस खोलना उपकला आंसू जाएगा.
- एक बार पीछे की ओर की पहचान की गई है, यह ऊपर की ओर मोड़ और बाएँ चिमटी में लेंस समझ (दाएँ हाथ के एक कार्यकर्ता के लिए). फिर सही करने के लिए एक छोटे से गुना उत्पादन चिमटी के साथ पीछे कैप्सूल चुटकी.
- जबकि सही चिमटी के साथ पीछे कैप्सूल पकड़े बाईं चिमटी के साथ कैप्सूल के गुना समझ और विपरीत दिशाओं में कैप्सूल में एक छोटे से आंसू बनाने के दो जोड़े खींच चिमटी.
- जबकि लोभी चिमटी के साथ retracting कैप्सूल के किनारे, यह नीचे खींच, एक तरफ पहले, तो दूसरी तरफ, यह चिमटी के साथ पकवान की प्लास्टिक में दबाव. यह कई बार दोहराएँ, लेंस के भूमध्य रेखा के आसपास चलती है, जब तक कैप्सूल मजबूती से कई बिंदुओं पर थाली से जुड़ा हुआ है. बाईं चिमटी के साथ जगह में कैप्सूल होल्डिंग, धीरे सही चिमटी के साथ फाइबर जन रॉक लेंस भूमध्य रेखा पर फाइबर कोशिकाओं और उपकला कोशिकाओं के बीच लगाव को तोड़ने. फिर फाइबर जन दूर धक्का, रोलिंग बंद कैप्सूल / उपकला, जो के नीचे से जुड़ी हैपकवान. पकवान में सभी लेंस के साथ इस प्रक्रिया को जारी रखें. निकालें और फाइबर जनता (या उन्हें अन्य अध्ययनों के लिए लेंस प्रोटीन का एक स्रोत के रूप में जमे हुए बचाने) त्यागें.
भाग 3: Microdissection और केंद्रीय explants की संस्कृति
सामग्री और अभिकर्मकों:
- बाँझ डिस्पोजेबल स्केलपेल, # 15, ब्लेड, (सिनसिनाटी सर्जिकल कंपनी Cincinnati, OH)
- बाँझ फॉस्फेट कैल्शियम और मैग्नीशियम (Invitrogen, Carlsbad, CA) के साथ खारा buffered
- संस्कृति मध्यम: सस्पेंशन मध्यम युक्त FGF-2 100ng/ml (सिग्मा Aldrich, इंक सेंट लुइस, MO).
प्रक्रिया:
- एक बाँझ स्केलपेल का प्रयोग, दूर परिधीय उपकला (पीई), जो भेदभाव (चित्रा 1 ए) के प्रारंभिक चरणों में सेल शामिल ट्रिम, एक पक्ष पर एक केंद्रीय वर्ग लगभग 2.0mm छोड़ने केंद्रीय उपकला कोशिकाओं से मिलकर ही (CE) (चित्रा 1B).
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के लिए केंद्रीय explants युक्त पकवान स्थानांतरण. बाँझ पीबीएस कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त और 1ml ताजा, equilibrated (37 ° सी, 5% सीओ 2) मध्यम निलंबन के साथ एक बार के साथ 3 बार धोएं. ये washes बहुत संदूषण की संभावना कम है.
- मध्यम संस्कृति के 2ml जोड़ें 1 भेदभाव प्रेरित है, और 37 पर एक humidified, टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में explants जगह ° सी, 5% सीओ 2 . संस्कृति की अवधि के रूप में कुछ घंटों के रूप में कम हो सकता है या विस्तार के रूप में दो से तीन सप्ताह के रूप में लंबे समय, अध्ययन किया जा रहा पैरामीटर पर निर्भर करता है हो सकता है. मध्यम हर दो से तीन दिनों बदला जाना चाहिए.
भाग 4: explants की फसल काटने वाले भेदभाव के साथ जुड़े घटनाओं के विश्लेषण के लिए
1. प्रोटीन या शाही सेना के विश्लेषण के लिए फसल काटने वाले explants
सामग्री:
- Microdissecting चिमटी
- एसडीएस lysis बफर या शाही सेना बाद में
प्रक्रिया:
- ऊष्मायन अवधि के अंत में, संस्कृति के माध्यम से हटा दें.
- स्टीरियो - विदारक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, धीरे प्रत्येक explant के किनारों को ढीला.
- चिमटी के साथ प्रत्येक explant लिफ्ट और यह एक 100μl एसडीएस lysis बफर (प्रोटीन विश्लेषण के लिए) या शाही सेना बाद में शाही सेना के विश्लेषण के लिए () के बारे में युक्त ट्यूब को हस्तांतरण. समाधान में चिमटी की नोक आंदोलन करने के लिए सुनिश्चित करें कि explant चिमटी के लिए छड़ी नहीं है.
2. Immunofluorescence के लिए फसल काटने वाले explants
सामग्री और अभिकर्मकों:
- फास्फेट कैल्शियम और मैग्नीशियम (Invitrogen, Carlsbad, CA) के साथ खारा buffered
- फास्फेट buffered खारा (कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) (Invitrogen, Carlsbad, CA)
- 4% paraformaldehyde (बोस्टन Bioproducts, Worcester, MA)
- Microdissecting चिमटी
- Hydrophobic अंकन कलम
- ग्लास खुर्दबीन स्लाइड
- फॉस्फेट में 0.25% ट्राइटन X-100 खारा buffered.
प्रक्रिया:
- पीबीएस कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त में explants संक्षिप्त कुल्ला.
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde जोड़कर ऊतकों को ठीक करें.
- लगानेवाला निकालें और जगह के साथ फॉस्फेट खारा buffered. फिक्स्ड explants कुछ कठोर हो जाते हैं, उन्हें उठाया जा करने के लिए और immunostaining के लिए गिलास स्लाइड के लिए हस्तांतरित की अनुमति.
- पीबीएस के एक छोटे से ड्रॉप (कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) ऊतक स्थिति और कर्लिंग को रोकने में मदद करने के लिए स्लाइड पर रखें. Microdissecting चिमटी का प्रयोग, explant लिफ्ट और यह स्लाइड पर ड्रॉप में डालें. Explant छू के बिना, ध्यान से तरल को एक कागज बाती के साथ दूर करने के लिए शीशे पर explant समतल और ऊतक शुष्क हवा में 3 से 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर.
चित्रा 1 ए परिधीय उपकला भेदभाव विशिष्ट प्रोटीन व्यक्त करता है. एन cadherin के लिए दिखाया explant microdissection के तुरंत बाद immunostained किया गया था. अभिव्यक्ति परिधीय उपकला कोशिकाओं के एक बैंड में देखा जाता है, यह दर्शाता है कि इस क्षेत्र में कोशिकाओं को बी. अंतर शुरू कर दिया है परिधीय उपकला दूर छंटनी की जा सकती कोशिकाओं को हटाने है कि व्यक्त एन cadherin और अन्य भेदभाव विशिष्ट प्रोटीन. लाल वलय कोशिकाओं है कि स्थान का प्रतिनिधित्व करता है एन cadherin व्यक्त है, जबकि छोटे भूरे रंग में उल्लिखित वर्ग 1A पैनल में दिखाया उपकला के वृत्त का चतुर्थ भाग का प्रतिनिधित्व करता है. परिधीय उपकला चार स्केलपेल कटौती द्वारा हटाया जा सकता है, एक मध्य वर्ग है कि केवल कोशिकाओं है कि अभी तक अंतर नहीं शुरू कर दिया है छोड़ने.
Discussion
चूहे लेंस explant सिस्टम सफलतापूर्वक किया गया है प्रयोगशालाओं की संख्या के लेंस 21,3,4,5 फाइबर लेंस उपकला कोशिकाओं के टर्मिनल भेदभाव अध्ययन के द्वारा प्रयोग किया जाता है. 100ng/ml पर FGF-2 को उजागर explants 6 मिनट के भीतर संकेतन में परिवर्तन दिखाने के morphology और जीन अभिव्यक्ति कई 3,4,5 दिनों में क्रमिक रूप से दिखने में परिवर्तन के साथ शुरू हो जाएगा. संस्कृतियों 2-3 हफ्तों के लिए व्यवहार्य रहते अगर देखभाल करने के लिए संक्रमण को रोकने के लिए लिया जाता है.
इस प्रोटोकॉल में वर्णित केंद्रीय explants भेदभाव के साथ जुड़े घटनाओं के अनुक्रम के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं, के बाद से वे कुछ होते हैं अगर किसी भी कोशिकाओं है कि FGF-2 से पहले भेदभाव मार्करों व्यक्त 1,5 जोड़ा जाता है. कोशिकाओं तो अंतर synchronously, एक पलटन के रूप में, संकेतन और transcriptional भेदभाव के साथ जुड़े घटनाओं के समय के पाठ्यक्रम का पालन करने के लिए यह संभव बना. समय के विभिन्न लंबाई के लिए संवर्धन explants इस प्रकार अनुक्रम घटनाओं के बारे में सटीक लौकिक जानकारी प्रदान करता है. विशिष्ट inhibitors संस्कृति के माध्यम से जोड़ा जा सकता है के लिए प्रासंगिक संकेत दे रास्ते की पहचान हैं. Explants एसडीएस जेल वैद्युतकणसंचलन और immunoblotting द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण या RT-पीसीआर द्वारा विशिष्ट mRNAs की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 600 एनजी / explant, संस्कृति अवधि की लंबाई पर निर्भर करता है - प्रोटीन 20-50 μg / explant और आरएनए उपज से पैदावार रेंज लगभग 200 है. आम तौर पर हम पाते हैं कि पकवान प्रति 5-6 explants कई assays के लिए पर्याप्त प्रोटीन या शाही सेना प्रदान करेगा. Explants से शाही सेना भी माइक्रोएरे विश्लेषण, जो उपन्यास जीन है कि भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है की पहचान कर सकते हैं द्वारा जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए सीडीएनए तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Explants ट्रांसफ़ेक्ट भी हो सकता है. हालांकि अभिकर्मक दक्षता आम तौर पर कम है, यह रिपोर्टर जीन 4 परख करने की क्रिया के लिए पर्याप्त है, 7 , 8. Explants के immunofluorescence माइक्रोस्कोपी हित के प्रोटीन के subcellular स्थान निर्धारित कर जैव रासायनिक तरीकों के लिए एक उपयोगी सहायक प्रदान करता है. इस प्रकार, तैयारी और चूहे लेंस explants के संस्कृति स्तनधारियों में टर्मिनल लेंस भेदभाव के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली है, जो ट्रांसजेनिक और नाक आउट चूहों की पीढ़ी के रूप में में vivo तकनीक में पूरक कर सकते हैं प्रदान करता है.
Acknowledgments
लेंस उपकला explants की तैयारी डॉ. जॉन 9 मैकएवॉय की प्रयोगशाला में उत्पन्न तरीकों से अनुकूलित किया गया है. यह काम राष्ट्रीय नेत्र संस्थान, अंदर का रिसर्च प्रोग्राम Z01-EY000238-22 के द्वारा वित्त पोषित है
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