Terminal Farklılaşma incelenmesi için hazırlanması ve Rat Lens Epitel eksplantlar Kültür

Summary

FGF-2 varlığı kültüre sıçan lens epitel merkez bölgesi eksplantlarındaki eşzamanlı ayırt. Gibi kültürlerin İmmünofloresan mikroskopi gen ekspresyonu ve terminal farklılaşma ile ilgili sinyalizasyon olaylar hakkında yeni bilgiler sağlar.

Abstract

Oküler lensin ön yüzeyinde siliyer cisim altta yatan bir anüler bölgesi prolifere epitel hücreleri, bir tek tabaka ile kaplıdır. Retina difüzyon FGF, onları uzatılmış objektif lens toplu oluşturan lif hücreleri, posterior diziye ayırt etmek için indükler bölümü takiben, bu hücrelerin, posteriora göç. FGF-2 varlığı ön epitel merkezi bölgenin kültür eksplantlar lens liflerinin içine lens epitel hücreleri farklılaşma in vitro olarak uyarılabilir. Eksplantlarındaki neonatal sıçanlarda lensler, gözün lensi çıkarmadan ve lens kapsülünün diseksiyon cımbız ile arka tarafındaki kavrama hazırlanmıştır. Daha sonra arka kapsül hafifçe açık parçalanmış ve plastik bir doku kültürü çanak dibine basılı. Eksplant periferik bölgelerinde bir neşter ile silinir ve daha sonra merkezi bir bölgede, incelenmesi gereken parametreler bağlı olarak 2-3 hafta gibi uzun bir FGF-2 100ng/ml varlığında kültüre. Hafta günlük bir süre içinde yaklaşık senkronize kültürlü eksplantlar epitel hücreleri ayırt bu yana, sinyalizasyon ve gen ekspresyonu zaman ders, moleküler, biyokimyasal ve farmakolojik teknikler kullanılarak tespit edilebilir. İmmünofloresan mikroskopi, bu yöntemlerin güçlü bir yardımcı ilgi proteinlerin hücre içi lokalizasyonu gösterir ve sinyal yolları deneysel manipülasyon fizyolojik sonuçlar ortaya çıkarabilir.

Protocol

Bölüm 1: lenslerin kaldırılması

Malzemeler ve reaktifler:

1. Mikro-diseksiyon makas, eğri, künt ipuçları, (böyle as.RS-5983, Roboz Cerrahi Instrument Co, Inc, Gaithersburg, MD); mikro diseksiyon cımbız, kavisli ucu (Roboz # RS5137 gibi).
2. Süspansiyon orta: Orta 199, 100 ünite sığır serum, albumin / ml penisilin% 0.1, 100μg/ml streptomisin, 2.5 mikrogram / ml Amfoterisin B Reaktifler içeren Invitrogen, Carlsbad, CA mevcuttur.

Prosedür:

1. National Institutes of Health, Bethesda, MD tarafından sağlanan yönergelere uygun olarak yeni doğan ratlarda Euthanize (2-4 gün arası).
2. Cerrahi makas ile göz kapaklarını çıkarın. Dışarıya doğru çıkıntı göz zorlamak için göz soket ters tarafta kavisli cımbız ile hafifçe basın. Makas ile gözün arka tarafında küçük bir kesi olun. Kesi karşısında göz kenarına cımbız ile basarak, lens ve bağlı vitreus küçük bir miktar daha sonra objektif kıvrımlı cımbız ile alınır sağlayan, rüptür sonucu zorla olabilir. Bakım lens kapsül kırmak için değil alınmalıdır.
3. 5ml sıcak, steril süspansiyon orta içeren bir 60mm plastik doku kültürü çanak lensler aktarmak için kavisli bir cımbız kullanın.

Bölüm 2: eksplant Mikrodisseksiyon

Malzemeler ve reaktifler:

1. Mikro Diseksiyon cımbız, 0,1 mm ipuçları, (Roboz RS-4976 gibi). Biz çünkü ucu esneklik Dumostar alaşım kullanabilirsiniz, ancak diğer çelik alaşımları de kabul edilir. Bu işlem sırasında mola veya viraj eğilimindedir 0.1mm daha ince ipuçları ile cımbız, tavsiye edilmez.
2. Süspansiyon orta (bkz. Bölüm 1)
3. Ham F12 orta veya Orta 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) Unsupplemented

Prosedür:

1. Aşağıdaki adımları steril kesme aletleri ve steril ortamda kullanarak, temiz, taslak ortamda yapılmalıdır.
2. Stereo diseksiyon mikroskop kullanarak, 0.1 mm uçlu cımbız ile yapışan herhangi bir doku lenslerinizi temiz ve 5ml steril süspansiyon orta (bu adım kirliliği azaltmak için yardımcı olur) içeren ikinci bir 60mm kültür çanağı aktarabilirsiniz. Cımbız ile istenilen sayıda lens, 35mm kültür çanak 5ml steril, unsupplemented orta içeren bir transfer. (Daha düşük boya konsantrasyonu diseksiyon daha kolay hale getirir, çünkü Biz sık sık, bu adım için Ham F12 (Invitrogen) kullanmak; Ancak, Orta 199 de kabul edilebilir olan bu adımı sırasında yok antibiyotik ya da diğer ekleri ihtiyaç duyulmaktadır..) 12 eksplantlar yapılmış olması. Gibi gibi birçok Bu boyuttaki bir çanak merkezi. Ancak, daha az eksplantlar kesme aletleri küçük bir tabak içinde kolayca manipüle edilebilir, çünkü yapılması bile 35 mm çanak kullanılmalıdır. 37 az bir doku kültürü inkübatör kalan lensler içeren çanak Transfer ° C kadar ihtiyaç vardır.
3. Lensin arka tarafında belirleyin. Bunu tanımak için birçok yol vardır: 1) posterior, anterior, daha hafif basık yuvarlak, diseksiyon sırasında oda sıcaklığı gibi serin 2) Yenidoğan sıçan lensler soğuk katarakt formu. Soğuk katarakt lensi tamamen dolu değilse, arka tarafı opak bölgeden uzak tarafı. Opacity çanak 37 ısınma, objektif doldurdu ° C'de birkaç dakika için tersine dönecektir. Arka tarafında soğutma üzerine katarakt reformlar olarak tespit edilebilir. 3) tunika vaskulosa lentis İzleri arka tarafında görülebilir. 4) posterior sütür arka tarafında görülebilir. Kapsül açılacak bu yana doğru arka tarafında belirlenmesi esastır. Ön tarafında Açılış lens epitel gözyaşı.
4. Arka tarafında tespit edildikten sonra, yukarı doğru açın ve sol cımbız lensi kavramak (sağ elini kullanan bir işçi için). Sonra küçük bir kıvrım üretmek doğru bir cımbız ile arka kapsül tutam.
5. Sağ cımbız ile arka kapsül tutarken, sol cımbız ile kapsül kat kavramak ve kapsül küçük bir gözyaşı yapmak zıt yönlerde iki çift cımbız çekin.
6. Cımbız ile geri çekilmeden kapsül kenarından kavrayarak, plastik cımbız ile çanak içine basarak, daha sonra diğer tarafta, bir tarafta ilk aşağı doğru çekin. Kapsül birçok noktada plaka sıkıca bağlı olduğu kadar, bütün lensin ekvator etrafında hareket, bu işlem birkaç kez tekrarlayın. Kapsül sol cımbız ile tutarak yavaşça sağ cımbız ile lens ekvatorda fiber hücreleri ve epitel hücreleri arasındaki eki kırmak için lif kütle kaya. Sonra alt takılı kalır kapsül / epiteli, haddeleme, uzak fiber kitle itinçanak. Çanak tüm lensler ile bu süreç devam etmektedir. Fiber kitleler (veya onlara lens proteinlerinin diğer çalışmalar için bir kaynak olarak dondurulmuş kaydetmek) çıkarın ve atın.

Bölüm 3: Mikrodisseksiyon ve kültür merkezi eksplant

Malzemeler ve reaktifler:

1. Steril tek kullanımlık bisturi, # 15 bıçak, (Cincinnati Cerrahi Co Cincinnati, OH)
2. Kalsiyum ve magnezyum (Invitrogen, Carlsbad, CA) ile steril fosfat tamponlu salin
3. Kültür orta: Süspansiyon orta içeren 100ng/ml FGF-2 (Sigma Aldrich, Inc St Louis, MO).

Prosedür:

1. Steril bir neşter kullanılarak, sadece (CE) (Şekil merkezi epitel hücrelerinde oluşan merkezi bir meydanı yaklaşık 2.0mm, bir tarafta bırakarak, farklılaşma (Şekil 1A) erken aşamalarında hücreler içeren periferik epitel (PE), uzak trim 1B).
2. Bir biyogüvenlik kabine merkezi eksplantlar içeren çanak aktarın. Steril PBS ile bir kez 1ml taze, dengelenmiş (37 ° C,% 5 CO ₂₎ süspansiyon orta kalsiyum ve magnezyum içeren ve 3 kere yıkayın. Bu bulaşma olasılığını büyük ölçüde azaltır yıkar.
3. Farklılaşma ¹ neden ve 37 nemlendirilmiş, doku kültürü inkübatör eksplantlar kültür ortamı 2mL ekle ° C,% 5 CO _2. Kültür dönemleri birkaç saat gibi kısa ya da çalışılan parametreye bağlı olarak, 2-3 hafta gibi uzun uzatmak. Orta 2-3 günde bir değiştirilmesi gerekir.

Bölüm 4: farklılaşma ile ilişkili olayların analizi için eksplantlar Hasat

1. Protein veya RNA analizi için Hasat eksplantlar

Malzemeler:

1. Microdissecting cımbız
2. SDS Lizis Tampon veya RNA daha sonra

Prosedür:

1. Kuluçka dönemi sonunda, kültür ortamı çıkarın.
2. Stereo diseksiyon mikroskobu kullanarak her eksplant kenarlarını hafifçe gevşetin.
3. Cımbız ile her eksplant kaldırın ve 100μl SDS lizis tamponu (protein analizi için) veya RNA daha sonra (RNA analizi için) ile ilgili içeren bir tüpe transfer. Eksplant cımbız sadık olmadığından emin olmak için çözüm cımbız ucu çalkalayın.

2. Immünofloresan için Hasat eksplantlar

Malzemeler ve reaktifler:

1. Fosfat, kalsiyum ve magnezyum (Invitrogen, Carlsbad, CA) ile tamponlu salin
2. Fosfat (Invitrogen, Carlsbad, CA) tamponlu tuz (kalsiyum ve magnezyum olmadan)
3. % 4 paraformaldehid (Boston Bioproducts, Worcester, MA)
4. Microdissecting cımbız
5. Hidrofobik işaretleme kalemi
6. Cam mikroskop lamı
7. Fosfat% 0.25 'lik Triton X-100 tamponlu salin.

Prosedür:

1. PBS, kalsiyum ve magnezyum içeren kısaca eksplantlar durulayın.
2. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehid ekleyerek doku sabitleyin.
3. Fiksatif çıkarın ve fosfat tuzlu tamponlu ile değiştirin. Sabit eksplantlar onları immün kaldırdı ve cam slaytlar transfer sağlayan, biraz sert olur.
4. PBS, doku pozisyonu yardımcı ve kıvrık önlemek için slaytta küçük bir damla (kalsiyum ve magnezyum olmadan) yerleştirin. Microdissecting cımbız kullanarak, eksplant asansör ve slayt açılan takın. Eksplant dokunmadan dikkatlice camına eksplant düzleştirmek için bir kağıt fitil ile sıvı çıkarın ve oda sıcaklığında 3 ila 5 dakika süreyle havada doku kurumaya bırakın.

Şekil 1 A periferik epitel farklılaşması spesifik proteinlerin ifade eder. Mikrodiseksiyon hemen sonra N-kaderin gösterilen eksplant immunohistokimyasal oldu. İfade bu bölgedeki hücrelerin periferik epitel hücreleri çıkarmak için kesilmiş olabilir. B. ayırt başlamış olduğunu gösteren, bir grup çevre epitel hücreleri görülür ifade N-kaderin ve diğer farklılaşma spesifik proteinlerin. Kırmızı annulus hücrelerin yerini açık gri belirtilen küçük kare panel 1A gösterilen epitel kadranda temsil ederken N-kaderin, temsil eder. Periferik epitel ayırt etmek için henüz başlamamış tek hücreleri içeren merkezi bir kare bırakarak dört neşter kesimler tarafından kaldırılabilir.

Discussion

Sıçan lens eksplant sistemi, laboratuvarlar, ^objektif lifleri 21,3,4,5 lens epitel hücrelerinin terminal farklılaşma çalışma bir dizi başarıyla kullanılır olmuştur. 100ng/ml FGF-2 maruz eksplantlar morfolojisi ve birkaç gün ^3,4,5 içinde sırayla görünmesini gen ekspresyon değişiklikleri dakika ⁶ içinde sinyalizasyon değişiklikler göstermeye başlayacaktır. Bulaşmasını önlemek için bakım alınırsa kültürler 2-3 hafta için geçerli kalır.

FGF-2 önce farklılaşma işaretleri ifade herhangi bir hücre ^1,5 eklenir az içerdikleri için bu protokolü açıklanan merkezi eksplantlar, farklılaşma ile ilişkili olaylar dizisi çalışmak için özellikle yararlıdır. Bu hücreler daha sonra farklılaşma ile ilgili sinyalizasyon ve transkripsiyonel olayların zaman seyrini takip etmek mümkün hale, bir kohort olarak, eş zamanlı olarak ayırt. Zaman farklı uzunluklarda kültür eksplantlar böylece sıra olaylar hakkında doğru Temporal bilgiler sağlar. Özel inhibitörleri ilgili sinyalizasyon yolları belirlemek için kültür ortamına ilave edilebilir. SDS jel elektroforezi ve immün eksplantlarındaki protein ekspresyonu analiz ya da RT-PCR ile spesifik mRNA'ların ifade analiz etmek için kullanılıyor olabilir. - 20-50 mikrogram / eksplant ve RNA verim protein verimi aralığı yaklaşık 200 kültür döneminin uzunluğuna bağlı olarak 600 ng / eksplant. Biz genel olarak ortalama 5-6 eksplantlar çanak birkaç deneyleri için yeterli protein veya RNA sağlayacak bulabilirsiniz. Eksplantlar RNA gen ekspresyonu farklılaşması için kritik olabilecek yeni genlerin belirlenmesi mikroarray analizi, değerlendirilmesi için cDNA hazırlamak için kullanılabilir. Eksplantlarındaki da transfekte olabilir. Transfeksiyon verimliliği genellikle düşük olsa da, o muhabir genler assaying ⁴ için ^{yeterli; 7, 8.} Eksplantlar immünofloresan mikroskopi ilgi proteinlerin hücre içi yerinin belirlenmesi için yararlı bir ek biyokimyasal yöntemler sağlar. Böylece, sıçan lens eksplant hazırlanması ve kültür, in vivo teknikleri, transgenik ve knock-out farelerde üretimi gibi tamamlayıcı memeliler terminal objektif farklılaşma çalışmak için güçlü bir sistem sağlar.