ترنسفكأيشن الحمض النووي لعضلات الهيكل العظمي باستخدام الثدييات في فيفو Electroporation
Summary
نحن تصف إجراءات تفصيلية لترنسفكأيشن فعالة من الحمض النووي البلازميد في ألياف عضلات القدم من الفئران الحية باستخدام electroporation والتصور لاحقة من بروتين تعبير باستخدام المجهر مضان.
Abstract
والاهتمام المتزايد في بيولوجيا الخلية وأشكال التعبير عن تعديل transgenically من البروتينات الضرورية (على سبيل المثال يبني الموسومة fluorescently و / أو المتغيرات متحولة) من أجل التحقيق في توزيعها وأهميتها الذاتية الوظيفية. مقاربة مثيرة للاهتمام التي تم تنفيذها لتحقيق هذا الهدف في خلايا متمايزة تماما هو<em> في الجسم الحي</em> ترنسفكأيشن من البلازميدات بواسطة أساليب مختلفة في أنسجة معينة مثل الكبد<sup> 1</sup> ، الهيكل العظمي والعضلات<sup> 2،3</sup> ، وحتى في الدماغ<sup> 4</sup>. نقدم هنا وصفا مفصلا للخطوات التي يجب اتباعها من أجل transfect بكفاءة في المادة الوراثية للألياف<em> المثنية القصيرة للأصابع</em> (FDB) و<em> بين العظمية</em> (IO) عضلات الفئران البالغة باستخدام<em> في الجسم الحي</em> نهج electroporation. وقد تم تحسين المعلمات التجريبية وذلك لزيادة عدد الألياف العضلية مع تقليل الأضرار transfected الأنسجة التي قد تنال من نوعية وكمية البروتينات التي أعرب عنها في الألياف الفردية. لقد تحققنا من أن تنفيذ المنهجية الواردة في هذه الورقة في نتائج عالية الغلة من البروتينات القابلة للذوبان ، أي EGFP وECFP<sup> 3</sup> ، calpain ، FKBP12 ، β2a – DHPR ، الخ ؛ البروتينات الهيكلية ، أي minidystrophin وα actinin ؛ وبروتينات الغشاء ، أي α1s – DHPR ، RyR1 ، القلب نا / CA<sup> 2 +</sup> مبادل ، NaV1.4 نا القناة ، SERCA1 ، وما إلى ذلك ، عندما يطبق على FDB ، IO والعضلات الأخرى من الفئران والجرذان. وقد تم التحقق من كفاءة التعبير عن بعض هذه البروتينات مع البيوكيميائية<sup> 3</sup> والأدلة الفنية<sup> 5</sup>. ومع ذلك ، إلى حد بعيد النهج الأكثر شيوعا التي يستخدمها التأكيدي منا المجهر الفلورسنت القياسية و2 – الفوتون المجهري مسح بالليزر (TPLSM) ، التي تسمح لتحديد ليس فقط التعبير عموما ، ولكن أيضا توطين مفصلة بين الخلايا ، ليبني البروتين الموسومة fluorescently. يمكن أن تكون الطريقة المستخدمة بالتساوي على transfect البلازميدات ترميز للتعبير عن بروتينات ذات الصلة الفسيولوجية (كما هو موضح هنا) ، أو للتدخل الحمض النووي الريبي (سيرنا) تهدف الى قمع التعبير عن البروتينات وأعرب عادة (وليس لنا بعد اختباره من قبل). وتجدر الإشارة إلى أن ترنسفكأيشن من ألياف العضلات وFDB IO ذات أهمية خاصة للتحقيق في فسيولوجيا الثدييات منذ ألياف العضلات إنزيمي فصلها من هذه العضلات هي حاليا واحدة من أكثر النماذج المناسبة للتحقيق في الآليات الأساسية لتوصيل الإثارة واستثارة الانكماش تحت الظروف الراهنة أو المشبك الجهد<sup> 2،6-8</sup>.
Protocol
Discussion
نحن هنا وصف الخطوات التفصيلية التي يجب اتباعها من أجل تحقيق فعالية transfections البلازميدات الحمض النووي في ألياف العضلات والهيكل العظمي التي electroporation في الجسم الحي. المزايا الرئيسية لنهجنا هي البساطة في التنفيذ ، والغزو ويعتبر الحد الأدنى الذي ينتج مخاطر صحية ضئيل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور T. أوتيس ، قسم علم الأعصاب ، جامعة كاليفورنيا ، لتقاسم مرفق TPLSM معنا ، الدكتور جيم Fahlke ، معهد الفيزيولوجيا ، آخن ، ألمانيا ، على سبيل الهبة الكريمة من البلازميد pEYFP – ClC1 ، والسيد . ر سيرانو للدعم التقني. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة / NIAMS المنح وAR047664 AR54816.
References
- Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery. Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers. J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).
- DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system. Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).
- Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons. Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle. Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).
- Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres. J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).
- DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).
- Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy. J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).
- Zipfel, W. R. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).
- Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres. Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).
- DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS. J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).
- Mills, M. Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy. Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).
- Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres. J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).
