Summary
我们描述了使用电和随后的可视化的表达蛋白，用荧光显微镜活体小鼠的脚部肌肉纤维的高效转染质粒DNA的详细程序。
Abstract
在细胞生物学中的一个越来越大的兴趣，是为了表达transgenically修改必需的蛋白质（如荧光标记的结构和/或突变的变种）的形式，以调查他们的内源性的分布和功能的相关性。一个有趣的方法，已实施完成这个目标，在完全分化的细胞是
Protocol
实验程序，在体内FDB和IO肌肉电
- 哺乳动物表达质粒体内电协议开始之前，必须扩增产量浓度的范围为2-5微克质粒/μL的TE 注意：我们经常使用的商业扩增试剂盒，并按照制造商的程序 。 商业表达质粒进行体内转染骨骼肌CMV启动子的工作很出色 。
- 分装量的必要（10-20μL）质粒的解决方案，并保存两个0.5 ml Eppendorf管中（每个鼠标脚）。
- 准备一个无菌台氏液中含有2毫克/毫升透明质酸。
- 用一个anesthetizing框，深受麻醉鼠标使用4％异氟醚与经批准的气体麻醉机在O2。放置在一个加热垫（37℃）的动物和维持麻醉，使用灭鼠面罩。监测麻醉深度脚趾捏反射。
- 根据与解剖镜下观察，在一只脚鼠标采用1英寸长的33计消毒针头的脚垫注入10μL的透明质酸酶的解决方案。穿透点靠近脚后跟的皮肤和皮下注射针迈向〜1 / 4“的脚趾基地。
- 如果需要的话，另一只脚重复该过程。
- 断开麻醉和鼠标放置在一个笼子里。允许它从麻醉中完全恢复。
- 一个小时后，麻醉动物和第二次放在加热垫。透明质酸酶的解决方案中描述的相同的步骤，注射20-50微克的质粒DNA（质粒构建的大小而定）。总的注射量应少于20μL/ 英尺注意：当15-20μL是必要的，它是最好，收于皮肤组织胶针切入点。
- 断开麻醉和鼠标放置在一个笼子里。允许它从麻醉中完全恢复，等待10-15分钟。
- 第三次麻醉动物和它放在加热垫。
- 选择一个动物的脚。在足跟部皮肤下放置一个镀金针，并在第二个脚趾的基础。电极相互垂直脚的长轴方向平行。
- 连接头的针（电极），使用微剪辑连接器的电刺激。 Electroporate应用20脉冲，持续时间/每个，20毫秒，以1Hz的肌肉。根据电极的间距，调整脉冲电压幅值（用示波器监测）产生电场〜100 V / cm 时注意：在无宫缩刺激应遵守的水平麻醉是足够的 。
- 如果需要的话，在动物的对侧脚重复上述程序。
- 笼子里的动物，一旦从麻醉中完全恢复下保持观察。注意：如果程序正常，动物应在30分钟内重新获得充分的流动性，事后被送回在动植物公园的动物房。透明质酸和脚垫的DNA注射没有明显的不利影响的动物。一旦从麻醉中恢复，小鼠能够笼子周围正常缓行。作为一个额外的预防措施，添加到饮用水为0.0027毫克/毫升2天止痛药的动物卡洛芬。
- 蛋白的表达可检测转染后2-8天。然而，许多蛋白的持续表达已经观察了好几个月。
注：所有动物的程序是，由加州大学洛杉矶分校校长的动物研究委员会批准的动物福利法“，对实验动物的人文关怀和使用小灵通的政策规定。
代表性的成果：
体内电上文所述的程序的正确实施，应在有效转染质粒在FDB和IO肌肉。然而，转基因蛋白变异体的表达效率将取决于质粒的规模和复杂性的蛋白质，蛋白质的功能特性，和其他一些变量，我们的控制。正如在图1电穿孔在商业质粒（PMR mCherry）mCherry蛋白编码存在的FDB肌肉所示，大部分的肌纤维转染与我们的协议，其中大多数是显示红色荧光的事实说明。这并不排除个别纤维表现出不同程度的蛋白表达的可能性，或没有在所有3个转，很少有纤维。应Ë指出， 大量 mCherry，EGFP，ECFP和EYFP的，如荧光蛋白的高效表达，不损害肌肉纤维的兴奋性和兴奋收缩偶联物业。事实上，他们是在深水（结果未显示）转肌肉的没有区别。
用来验证本地化表达荧光标记的蛋白在骨骼肌纤维的实际办法。
堤诺表达的转基因蛋白的细胞内定位是同时获得定期评估，使用TPLSM，各自的标签和图像识别标记的细胞结构的荧光图像。其中后者最典型的有：一）二次谐波产生（SHG）的图像，这从一个乐队（居中的M线）9,10的肌节肌球蛋白各向异性出现，B）DI - 8 - ANEPPS荧光图像，可通过标签表面和横向的管状这impermeant电位dye11的肌纤维（T型小管）系统膜获得。在肌纤维染色与DI - 8 - ANEPPS的荧光图像，T型管出现荧光导向纤维长轴约正交的窄带。这些频带间隔不等对方：它们是由很长的距离跨越，跨越的M线和跨越整个的Z - 11行是短暂的分离。
骨骼肌纤维的α-辅肌动蛋白- EGFP的表达及本地化。
α-辅肌动蛋白是标签的变体的结构肌肉蛋白的表达的一个例子如图2所示。这种蛋白质是已知的Z线的重要组成部分，正因为如此，经常使用这structure12标记。我们转染质粒pEGFPN1 -α- actinin1人类（非肌肉）编码FDB和IO肌肉α-辅肌动蛋白在C端与EGFP标记。转染后6天，我们发现，作为评估EGFP荧光分布，α-辅肌动蛋白是主要表达了同样沿纤维轴向间距窄波段。看到每个肌节的单波段（图2A和2D）。这些频段与Z线的共定位表明倍频（图2B）和DI - 8 - ANEPPS（图2E）的图像进行比较EGFP荧光的分布。叠加图像（图2C），α-辅肌动蛋白- EGFP的波段二次谐波频段的替代，说明他们连续两次的M -带位于中间，正好与Z型线的位置。在转的肌肉纤维染色与DI - 8 - ANEPPS，α-辅肌动蛋白- EGFP频段看到每一双T型管（图2F），这是众所周知的侧翼的Z线（即在较短距离分隔）之间为中心，从而表明，转基因α-辅肌动蛋白是有针对性地对Z -线。
在N -末端与EGFP表达标签的DHPRα1s
肌肉转染效率与pEGFPC1.1 DHPRα1S验证TPLSM图像显示（如图3A）大多数纤维表达EGFP的DHPRα1s（一种跨膜蛋白）。转染纤维的最突出的特点是双带的模式EGFP荧光（图3A及3B），将预计，如果这种蛋白质是有针对性地的T管。它也可以在图3中，而显示不同的纤维的荧光强度各级，带状个别纤维的荧光模式似乎保持均匀的沿纤维。在更高的放大倍率（图3B），它可以清楚地看到的乐队之间的不平衡间距是在纤维染色DI - 8 - ANEPPS（例如图2E）观察到类似。说明的倍频带位于EGFP -DHPRα1s乐队之间的间距较大，证实该蛋白在T管的覆盖图像（图3B＆3E）。额外的FRET测量与非荧光的亲脂性阴离子政治部（数据未显示），进一步表明，EGFP的基团是在几纳米的T型管的内层膜单张。
本地化和EYFP的ClC1表达功能的评价
纤维转pEYFP - ClC1与EGFP -DHPRα1s观察到类似的模式，它编码一个EYFP的标签构造骨骼肌氯离子通道（ClC1），显示EYFP的荧光条带（图4A）（N -末端） “表达（图3A）和相应的DI - 8 - ANEPPS染色（图2E）所示的T型小管安排。正如预期的那样，EYFP ClC1（图4A）和SHG影像（图4B），覆盖（图4C）所示的叠加，说明，SHG带为中心的大间距ØF EYFP的荧光带之间。
为了评估是否在显着增加的肌肉纤维，如预期般从功能氯离子通道表达的休息电导EYFP ClC1结果的表达，我们从转的FDB肌肉酶分离的肌纤维和研究他们的电生理特性用两个微电极实验装置描述以前6,11,13。图5显示了两种纤维的结果：一是表达大量EYFP - ClC1的全球标准的荧光显微镜的荧光强度测量（未显示）的评估，和其他非转控制。图5A电压的记录（表达EYFP - ClC1从肌肉纤维获得）表明，由于过度的休息电导，纤维几乎是不兴奋的。为了引出一个非常小的积极响应（无超调，图5A），需要使用电流刺激脉冲高达400nA（为0.5ms）。更换一个包含9 - ACA的氯离子通道阻滞剂500微米的外部Tyrode液后，200 nA电流脉冲足以引起动作电位（图5B），虽然慢得多，比那些记录在控制纤维更广泛的（图5C）。正如预期的那样，除了9 - ACA了这种控制纤维的影响不大（图5D）。
图1 在体内电穿孔法转染效率。明视（A）和荧光（二）转FDB肌肉的图像与PMR - mCherry 。电协议后的天数：12天。请点击这里为图1的放大版本。
图2。FDB 纤维的α-辅肌动蛋白- EGFP的表达和定位。小组，A和B是EGFP荧光和二次谐波图像，分别表达α-辅肌动蛋白- EGFP光纤，。 C组是一个图像叠加在A和B。面板D和E是另一种表达α-辅肌动蛋白与DI - 8 - ANEPPS - EGFP和染色，分别纤维的荧光图像。小组F是在D和E日电协议后的图像叠加：6天。
图3。 表达EGFP -DHPRα1s针对FDB纤维 。 A组，一组表达EGFP -DHPRα1s纤维EGFP的荧光图像。 B组是一个正方形的扩大，在面板中为了更好地显示蛋白表达的条带状格局。 C组是倍频影像相应的面板A.小组ð形象，图像的叠加A和C。小组E是面板D.日电协议后表示该地区的扩大：20天。
图4。FDB 纤维EYFP - ClC1的表达和定位。面板A和B是EYFP的荧光和二次谐波图像，分别表达EYFP - ClC1纤维。 C组是A和B小组ð是沿着电协议后面板C.天的形象突出了白线的强度分布在面板的图像叠加：7天。
图5。 电生理评估纤维表达转基因EYFP - ClC1小组 A和B是从响应电流脉冲表达EYFP - 9 - ACA治疗前后ClC1，分别纤维电压记录。前和治疗后分别与9 - ACA，面板C和D是在非转光纤电流脉冲响应（动作电位）引起的电压记录。
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Discussion
我们在这里描述应当遵循的，为了达到有效的DNA质粒转染骨骼肌纤维在体内电的详细步骤。我们的方法的主要优点是实现简单，其最小的侵袭，在对动物的健康危害可以忽略不计结果。在现实中，上面介绍的电协议不涉及两个皮下注射每英尺，通过电刺激的协议，所有这一切都是在麻醉状态下的动物的耐受性良好，远远高于。在我们的机构，这些操作是完全确定的非手术的程序，因为它们不涉及皮肤开幕。此外，温和的电击程序是为实现一个高效的质粒转染和随后由肌纤维蛋白的表达，因为任何重大的细胞损伤，会损害自己的能力，有效地从事活性蛋白的合成的整体成功的关键因素。
此处描述的步骤进行一些小的调整可以（已经）鼠标脚（ 如伸趾长肌，EDL;胫前，电讯管理局局长;，比目鱼肌）较大的肌肉实施。此外，刚刚扩大的DNA总量，我们已经实施了确切的程序，为了描述在这里取得了巨大成功转染大鼠的FDB和IO的肌肉。
虽然转染协议始终结果在一个变量的肌肉纤维的转基因蛋白的表达水平，这可以被利用在生理实验;非表达纤维可作为对照，以及与不同的表达水平纤维可用于关联表达水平与职能转变的水平。此外，巨细胞病毒的促销员已经发现，将在合适的高产高蛋白质表达水平，其他肌肉特异性启动子，可提高蛋白表达的疗效。应该指出，当它是不可能的（或方便）来表达荧光标记的肌纤维蛋白结构，我们已经成功地在未标记的蛋白质表达和监督双顺反子质粒，同时编码一种荧光蛋白的表达水平。
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Acknowledgments
我们感谢T.奥的斯，博士，加州大学洛杉矶分校神经生物学系，与我们一起分享TPLSM设施，三Fahlke博士，生理研究所，德国亚琛工业大学，，pEYFP ClC1质粒的捐赠，和先生R.塞拉诺为技术支持。这项工作是由来自美国国立卫生研究院/ NIAMS补助AR047664和AR54816的赠款支持。
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