사용 포유류 골격 근육의 유전자 Transfection VIVO에서 Electroporation

Summary

우리는 electroporation과 형광 현미경을 사용하여 단백질 표현의 후속 시각화를 사용하여 라이브 생쥐의 발 근육의 섬유에 플라스미드 DNA의 transfection 효율에 대한 자세한 절차를 설명합니다.

Abstract

세포 생물학에 관심이 점점 자신의 내생적인 분포와 기능 관련을 조사하기 위해 필수적인 단백질 (예 : 찬란 태그를 구성 및 / 또는 돌연변이 변종)의 transgenically 수정된 형태를 표현하는 것입니다. 완전히 차별화된 세포에서이 목표를 성취하기 위해 구현되었습니다 흥미로운 접근 방식입니다

Protocol

FDB 및 IO 근육의 생체내 electroporation에 대한 실험 절차

1. . 생체내의 electroporation 프로토콜의를 시작하기 전에, 포유류의 표현 plasmids는 2-5 μg TE의 μl / 플라스미드 참고 범위의 농도를 얻을 수로 증폭해야합니다 우리는 정기적으로 상업 증폭 키트를 사용하여 제조 업체 '절차를 따르십시오. 생체내 transfections의 골격근에서 매우 잘 CMV 프로 모터의 작동 실은 상업 표현 plasmids.
2. 나누어지는 필요한 플라스미드 솔루션의 볼륨 (10-20 μl)와 두 0.5 ML Eppendorf 튜브 (마우스의 각 발에 하나씩)에 저장합니다.
3. 무균 Tyrode 2 MG / ML hyaluronidase를 포함하는 솔루션을 준비합니다.
4. anesthetizing 상자를 사용하여, 깊이 승인 가스 마취 기계와 O2의 isoflurane 4 % 사용하여 마우스를 마취. 손난로 (37 ° C)에서 동물을 놓고 쥐 얼굴 마스크를 사용하여 마취를 유지합니다. 발가락 핀치 반사하여 마취 심도를 모니터링합니다.
5. 해부 현미경과 관찰에서 1 "길이 33 게이지 바늘을 사용하여 살균 마우스 한....

Discussion

우리는 여기서 생체내의 electroporation에 의해 골격 근육 섬유로의 DNA plasmids 효과 transfections을 달성하기 위해 따라야 할 자세한 단계를 설명합니다. 우리의 접근 방법의 주요 장점은 구현의 단순하고, 동물 무시할 건강 위험의 결과는 최소한의 invasiveness 있습니다. 현실에서는, 위에서 설명한 electroporation 프로토콜은 마취에서 동물에 의해 잘 용납하는 모든 중 전기 자극 프로토콜에 의해 뒤에 걸어서 당 두 피하 주사보다 더 많은 것들을 수반하지 않습니다. 저희 기관에서 이러한 조작은 모두 그들은 피부의 열기를 포함하지 않기 때문에 비 수술 절차로 결정됩니다. 게다가, electroporation 절차의 온후은 중요한 세포 손상이 효율적으로 활성 단백질 합성에 관여하는 능력에 악영향을 줄 것입니다 때문에 근육 섬유에 의해 효율적인 플라스미드 transfection 및 후속 단백질 표정을 취득에있는 전반적인 성공을위한 중요한 요소입니다.