Мы описываем подробные процедуры для эффективной трансфекции ДНК плазмиды в волокнах мышц стопы живых мышах электропорации и последующей визуализации экспрессии белка с помощью флуоресцентной микроскопии.
Растущий интерес к клеточной биологии заключается в выражении transgenically изменение формы необходимых белков (например, флуоресцентной меткой конструкций и / или мутантных вариантов) с целью изучения их распределения эндогенных и функциональной значимости. Интересный подход, который был реализован для выполнения этой задачи в полностью дифференцированных клеток<em> В естественных условиях</em> Трансфекции плазмиды с помощью различных методов в специфические ткани, такие как печень<sup> 1</sup>, В скелетных мышцах<sup> 2,3</sup>, И даже мозг<sup> 4</sup>. Приведем здесь подробное описание шагов, которые необходимо соблюдать для того, чтобы эффективно трансфекции генетического материала в волокнах<em> Сгибателей пальцев Brevis</em> (FDB) и<em> Interosseus</em> (IO) мышц взрослых мышей использованием<em> В естественных условиях</em> Электропорации подход. Экспериментальные параметры были оптимизированы так, чтобы максимизировать количество мышечных волокон трансфекции при минимизации ткани убытки, которые могут ухудшить качество и количество белков выражается в отдельных волокон. Мы убедились, что реализация методологии, описанной в этой статье приводит к высоким выходом растворимые белки, т.е. EGFP и ECFP<sup> 3</sup>, Кальпаин, FKBP12, β2a-DHPR и т.д.; структурные белки, т.е. minidystrophin и α-актинина; и мембранных белков, то есть α1s-DHPR, RyR1, сердечная Na / Ca<sup> 2 +</sup> Теплообменник, NaV1.4 Na канал, SERCA1 и т.д., при нанесении на FDB, И. О. и других мышц мышей и крыс. Эффективное выражение некоторых из этих белков была проверена с биохимическими<sup> 3</sup> И функциональных доказательств<sup> 5</sup>. Тем не менее, на сегодняшний день наиболее распространенными подтверждающего подход, используемый нами стандартных флуоресцентной микроскопии и 2-фотон лазерной сканирующей микроскопии (TPLSM), которые позволяют выявить не только общие выражения, но и подробные внутриклеточной локализации, флуоресцентно меткой конструкций белка. Метод может быть в равной степени использоваться для трансфекции плазмиды кодировки для экспрессии белков физиологических релевантности (как показано на рисунке), или для РНК-интерференции (миРНК), направленных для подавления экспрессии обычно выражается белков (не проверялась нами пока). Следует отметить, что трансфекции волокон FDB и IO мышц имеет особое значение для исследования физиологии млекопитающих, так как волокна мышц ферментативно отделены от этих мышц в настоящее время одним из наиболее подходящих моделей для исследования основных механизмов сцепления возбудимость и возбуждение-сжатия под тока или напряжения условия зажим<sup> 2,6-8</sup>.
Мы описываем здесь подробные шаги, которые следует соблюдать, чтобы достичь эффективной трансфекции ДНК плазмиды в скелетные мышечные волокна путем в естественных условиях электропорации. Основные преимущества нашего подхода являются простота реализации и ее минимальная инваз…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим д-р Т. Отис, Департамент нейробиологии, UCLA, для обмена TPLSM объекта с нами, д-р К. Fahlke, Институт физиологии, Аахена, Германия, за добрые пожертвования pEYFP-ClC1 плазмиды, и г-н . Р. Серрано для технической поддержки. Эта работа была поддержана грантами NIH / NIAMS гранты AR047664 и AR54816.