Summary
हम रहते electroporation और प्रोटीन अभिव्यक्ति का उपयोग कर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के बाद दृश्य का उपयोग कर चूहों के पैर की मांसपेशियों के तंतुओं में प्लास्मिड डीएनए के कुशल अभिकर्मक के लिए विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन हैं.
Protocol
FDB और कब मांसपेशियों के vivo electroporation में के लिए प्रायोगिक प्रक्रिया
- Vivo electroporation प्रोटोकॉल में शुरू करने से पहले, स्तनधारी अभिव्यक्ति plasmids 2-5 μg प्लाज्मिड / ते के μl नोट की रेंज में एकाग्रता उपज परिलक्षित होना चाहिए: हम नियमित रूप से वाणिज्यिक प्रवर्धन किट का उपयोग करें और 'निर्माता की प्रक्रियाओं का पालन. वाणिज्यिक अभिव्यक्ति सीएमवी प्रमोटर काम vivo में transfections में कंकाल की मांसपेशी में बहुत अच्छी तरह से ले जाने plasmids.
- विभाज्य प्लाज्मिड समाधान के लिए आवश्यक (10-20 μl) की मात्रा और यह दो 0.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब (एक माउस के प्रत्येक पैर के लिए) में सहेजें.
- एक बाँझ Tyrode में 2 मिलीग्राम / एमएल hyaluronidase युक्त समाधान तैयार है.
- एक anesthetizing बॉक्स का उपयोग, गहरी एक 4% एक अनुमोदित गैस संवेदनाहारी मशीन के साथ O2 में isoflurane माउस का प्रयोग कर anesthetize. एक हीटिंग पैड (37 डिग्री सेल्सियस) पर जानवर प्लेस और एक कृंतक चेहरे नकाब का उपयोग संज्ञाहरण बनाए रखने. पैर के अंगूठे चुटकी पलटा द्वारा संवेदनाहारी गहराई मॉनिटर.
- एक विच्छेदन खुर्दबीन के साथ निगरानी के तहत, एक 1 "लंबे समय 33 गेज बाँझ सुई का उपयोग कर माउस के एक पैर के footpads के तहत hyaluronidase समाधान के 10 μL इंजेक्षन. एक पैर की एड़ी के करीब बिंदु पर त्वचा घुसना और सुई 1 / 4 ~ "के लिए पैर की उंगलियों के आधार की ओर subcutaneously अग्रिम.
- दूसरे पैर के साथ प्रक्रिया दोहराएँ यदि हां, तो वांछित.
- संज्ञाहरण डिस्कनेक्ट और एक पिंजरे में माउस जगह. यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से ठीक करने के लिए अनुमति दें.
- एक घंटे के बाद एक दूसरी बार के लिए पशु anesthetize और हीटिंग पैड पर यह जगह. एक ही hyaluronidase समाधान के लिए में वर्णित प्रक्रिया के बाद, प्लास्मिड डीएनए (प्लाज्मिड निर्माण के आकार पर निर्भर करता है) के 20-50 μg की कुल इंजेक्षन. कुल इंजेक्शन की मात्रा कम से कम 20 μL / पैर हो नोट करना चाहिए: जब 15-20 μ एल आवश्यक है, यह सलाह दी जाती है सुई प्रविष्टि बिंदु पर त्वचा ऊतक गोंद के साथ बंद .
- संज्ञाहरण डिस्कनेक्ट और एक पिंजरे में माउस जगह. यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से उबरने के लिए और 10-15 मिनट के लिए प्रतीक्षा की अनुमति दें.
- तीसरी बार के लिए पशु anesthetize और हीटिंग पैड पर यह जगह.
- जानवर के एक पैर का चयन करें. एक प्लेस सोना चढ़ाया एड़ी पर त्वचा के नीचे एक्यूपंक्चर सुई, और पैर की उंगलियों के आधार पर एक दूसरे एक. इलेक्ट्रोड एक दूसरे से और पैर की लंबी अक्ष को सीधा करने के लिए उन्मुख समानांतर कर रहे हैं.
- बिजली सूक्ष्म क्लिप कनेक्टर्स का उपयोग उत्तेजक औधधि के लिए सुइयों के सिर (इलेक्ट्रोड) कनेक्ट. 1Hz पर 20 दालों, 20 / अवधि प्रत्येक, में एमएस लागू करने के द्वारा मांसपेशियों Electroporate. इलेक्ट्रोड की रिक्ति के आधार पर, 'दालों वोल्टेज आयाम (एक आस्टसीलस्कप के साथ निगरानी के द्वारा) निकाला जाता है ~ 100 वी / सेमी नोट के एक बिजली के क्षेत्र उपज: उत्तेजनाओं के जवाब में कोई संकुचन मनाया जाना चाहिए अगर के स्तर संज्ञाहरण पर्याप्त है.
- यदि ऐसा है तो वांछित है, जानवर के contralateral पैर में उपरोक्त प्रक्रिया दोहराएँ.
- अपने पिंजरे के लिए जानवरों की वापसी और एक बार पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद यह प्रेक्षण के तहत बनाए रखने के. नोट: अगर प्रक्रिया सामान्य रूप से चला गया, जानवर 30 मिनट के भीतर पूरा गतिशीलता हासिल और बाद में मछली पालने का बाड़ा में पशु कमरे में वापस भेजा जा करने के लिए तैयार है चाहिए. hyaluronidase और footpads में डीएनए के इंजेक्शन पशुओं पर नजर प्रतिकूल प्रभाव नहीं है. एक बार संज्ञाहरण से बरामद, चूहों पिंजरे के आसपास सामान्य टहलना कर रहे हैं. एक अतिरिक्त एहतियात के रूप में, 0.००२७ मिलीग्राम / एक एनाल्जेसिक के रूप में 2 दिनों के लिए मिलीलीटर पशु Carprofen के पीने के पानी के लिए जोड़ें.
- प्रोटीन अभिव्यक्ति अभिकर्मक के बाद 2-8 दिनों assayed किया जा सकता है है. हालांकि, कई प्रोटीन की निरंतर अभिव्यक्ति महीनों के लिए रखा गया है.
नोट: सभी पशु प्रक्रियाओं UCLA चांसलर पशु अनुसंधान समिति द्वारा अनुमोदित किया गया के रूप में पशु कल्याण अधिनियम और इंसानियत और प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग पर PHS नीति द्वारा सौंपा.
प्रतिनिधि परिणाम:
vivo electroporation ऊपर वर्णित प्रक्रिया में सही कार्यान्वयन FDB और कब मांसपेशियों में plasmids के प्रभावी अभिकर्मक में परिणाम चाहिए. हालांकि, ट्रांसजेनिक प्रोटीन वेरिएंट की अभिव्यक्ति की क्षमता प्लाज्मिड पर निर्भर करेगा, और प्रोटीन, प्रोटीन के कार्यात्मक संपत्तियों, और अन्य चर के हमारे नियंत्रण से बाहर संख्या के आकार और जटिलता. के रूप में एक FDB mCherry प्रोटीन के लिए एक वाणिज्यिक प्लाज्मिड एन्कोडिंग (PMR mCherry) की उपस्थिति में electroporated मांसपेशियों के लिए चित्रा 1 में सचित्र, मांसपेशी फाइबर की सबसे हमारे प्रोटोकॉल के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं के रूप में तथ्य यह है उनमें से ज्यादातर लाल प्रतिदीप्ति प्रदर्शन द्वारा सचित्र. यह संभावना है कि व्यक्तिगत फाइबर प्रोटीन अभिव्यक्ति के विभिन्न डिग्री प्रदर्शन नहीं शासन करता है, या कि कुछ फाइबर सभी 3 पर नहीं ट्रांसफ़ेक्ट हैं. यह ख चाहिएई ने कहा कि mCherry, EGFP, ECFP, और EYFP जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन की बड़ी मात्रा में के कुशल अभिव्यक्ति, मांसपेशी फाइबर excitability और उत्तेजना - संकुचन युग्मन गुण ख़राब नहीं करता है . वास्तव में, वे नकली ट्रांसफ़ेक्ट मांसपेशियों (नहीं दिखाया परिणाम है) में उन लोगों से अप्रभेद्य हैं.
व्यावहारिक दृष्टिकोण कंकाल की मांसपेशी फाइबर में fluorescently टैग प्रोटीन का स्थानीयकृत अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया.
di नोवो व्यक्त ट्रांसजेनिक प्रोटीन के intracellular स्थानीयकरण नियमित रूप से प्राप्त एक साथ द्वारा मूल्यांकन किया जाता है, सेलुलर संरचनाओं की अच्छी तरह से पहचान मार्करों के संबंधित टैग और छवियों के TPLSM, फ्लोरोसेंट छवियों का उपयोग कर. इन बाद के सबसे विशिष्ट हैं:) दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) छवियों, और जो sarcomeric (एम लाइनों पर केन्द्रित) बैंड 9,10 के मायोसिन anisotropy से उठता है, ख) प्रतिदीप्ति di-8-ANEPPS छवियों, जो सतह और अनुप्रस्थ ट्यूबलर इस impermeant potentiometric dye11 के साथ मांसपेशी फाइबर की झिल्ली (टी छोटी नली) प्रणाली लेबलिंग करके प्राप्त किया जा सकता है. Di-8-ANEPPS के साथ दाग मांसपेशी फाइबर की छवियों प्रतिदीप्ति में, टी tubules प्रतिदीप्ति उन्मुख लगभग फाइबर की लंबी अक्ष के लिए orthogonal संकीर्ण बैंड के रूप में दिखाई देते हैं. ये बैंड असमान एक दूसरे से स्थान दिया गया है: वे एक लंबी दूरी की है जो एम लाइनों के पार spans, और एक कम एक है कि Z लाइन 11 के पार spans के द्वारा अलग कर रहे हैं.
अभिव्यक्ति और α actinin-EGFP के कंकाल की मांसपेशी फाइबर में स्थानीयकरण.
संरचनात्मक प्रोटीन मांसपेशियों के एक टैग प्रकार की अभिव्यक्ति का एक उदाहरण α-actinin चित्रा 2 में दिखाया गया है. इस प्रोटीन Z लाइन के एक प्रमुख घटक होने के लिए जाना जाता है और, जैसे, नियमित रूप से इस structure12 के एक मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है. हम मानव गैर (मांसपेशी) के लिए प्लाज्मिड एन्कोडिंग pEGFPN1-α-actinin1 के साथ FDB और कब मांसपेशियों ट्रांसफ़ेक्ट α actinin EGFP सी के साथ टर्मिनल पर टैग. अभिकर्मक के छह दिन बाद, हमने पाया है कि, के रूप में EGFP प्रतिदीप्ति वितरण, α actinin ज्यादातर संकीर्ण बैंड फाइबर अक्ष के साथ समान रूप से दूरी में व्यक्त किया है द्वारा मूल्यांकन. Sarcomere प्रति एक एकल बैंड (आंकड़े 2A एवं 2D) में देखा जाता है. जेड लाइनों के साथ इन बैंड के colocalization EGFP प्रतिदीप्ति का वितरण (चित्रा 2B) एसएचजी और di-8-ANEPPS (चित्रा 2 ई) छवियों के साथ तुलना करके प्रदर्शन किया है. उपरिशायी छवि (चित्रा -2), α-actinin EGFP बैंड एसएचजी बैंड के साथ वैकल्पिक द्वारा दिखाया गया है, यह दर्शाता है कि वे लगातार दो एम बैंड के बीच रास्ते के मध्य में स्थित हैं, Z लाइनों के स्थान के साथ coinciding. ट्रांसफ़ेक्ट मांसपेशियों di-8-ANEPPS के साथ दाग फाइबर में, α actinin-EGFP बैंड देखा (चित्रा 2 एफ) टी tubules जो दिशा के लिए जेड लाइनों (अर्थात् एक कम दूरी के द्वारा अलग) जाना जाता है के हर जोड़ी के बीच केन्द्रित कर रहे हैं, इस प्रकार का संकेत है कि ट्रांसजेनिक α-actinin Z लाइन के लिए लक्षित है.
DHPRα1s की अभिव्यक्ति EGFP के साथ एन टर्मिनस पर टैग
pEGFPC1.1 DHPR α 1s के साथ मांसपेशियों अभिकर्मक की दक्षता में दिखा रहा है कि TPLSM (जैसे चित्रा 3A) छवियों सत्यापित किया जाता है सबसे फाइबर EGFP DHPRα1s व्यक्त (एक transmembrane प्रोटीन ). ट्रांसफ़ेक्ट तंतुओं के सबसे प्रमुख विशेषता डबल बंधी EGFP प्रतिदीप्ति (आंकड़े 3A और 3B) के पैटर्न के रूप में अगर इस प्रोटीन टी tubules को लक्षित किया गया था की उम्मीद होगी. यह भी चित्रा 3 में मनाया जा सकता है कि जब विभिन्न फाइबर प्रतिदीप्ति तीव्रता के विभिन्न स्तरों को प्रदर्शित करते हैं, एक व्यक्ति फाइबर की बंधी प्रतिदीप्ति पैटर्न फाइबर के साथ सजातीय बनाए रखा जा रहा है. उच्च आवर्धन (3B चित्रा) में, यह स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है कि बैंड के बीच असमान रिक्ति di-8-ANEPPS (जैसे चित्रा 2 ई) दाग फाइबर में मनाया है कि समान है. उपरिशायी छवियों (चित्रा 3B और 3E) का वर्णन है कि एसएचजी बैंड EGFP-DHPRα1s बैंड के बीच में बड़ा रिक्ति के भीतर स्थित हैं, corroborating है कि इस प्रोटीन टी tubules पर है. गैर फ्लोरोसेंट lipophilic आयनों के साथ अतिरिक्त माप झल्लाहट DPA (नहीं दिखाया डेटा है) आगे दिखाना है कि EGFP आधा भाग 'टी tubules झिल्ली के भीतर पुस्तिका के कुछ नैनोमीटर के भीतर है.
स्थानीयकरण और EYFP - ClC1 के अभिव्यक्ति की कार्यात्मक मूल्यांकन
PEYFP ClC1, जो एक EGFP-DHPRα1s के लिए मनाया है कि समान पैटर्न के साथ कंकाल की मांसपेशी क्लोराइड चैनल (ClC1), प्रदर्शन EYFP प्रतिदीप्ति बैंड (चित्रा -4 ए) के एक EYFP टैग का निर्माण (एन टर्मिनल पर) encodes के साथ ट्रांसफ़ेक्ट फाइबर '(चित्रा 3A) अभिव्यक्ति और di-8-ANEPPS धुंधला (चित्रा 2 ई) के साथ टी tubule सचित्र के रूप में व्यवस्था करने के लिए इसी. जैसी उम्मीद थी, superimposition की EYFP - ClC1 (4A चित्रा) और एसएचजी (4B चित्रा) छवियों के रूप में उपरिशायी (चित्रा 4C) में दिखाया गया है उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए, कि एसएचजी बैंड बड़े रिक्ति ओ पर केंद्रित कर रहे हैंEYFP प्रतिदीप्ति बैंड के बीच च.
आदेश में आकलन है कि मांसपेशी फाइबर के रूप में कार्यात्मक क्लोराइड चैनलों की overexpression से उम्मीद के आराम प्रवाहकत्त्व में एक उल्लेखनीय वृद्धि में EYFP ClC1 परिणाम की अभिव्यक्ति, enzymatically dissociated ट्रांसफ़ेक्ट FDB मांसपेशियों से मांसपेशी फाइबर और हम उनके electrophysiological गुणों का अध्ययन एक दो microelectrodes का उपयोग प्रयोगात्मक स्थापना 6,11,13 पहले से वर्णित है. EYFP ClC1 की बड़ी मात्रा में व्यक्त के रूप में एक मानक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी में वैश्विक प्रतिदीप्ति तीव्रता का माप (नहीं दिखाया गया है) से मूल्यांकन, और अन्य गैर ट्रांसफ़ेक्ट नियंत्रण: 5 चित्रा दो तंतुओं से परिणाम से पता चलता है. चित्रा 5A में वोल्टेज रिकॉर्ड (EYFP - ClC1 व्यक्त मांसपेशी फाइबर से प्राप्त) अत्यधिक आराम प्रवाहकत्त्व के लिए कारण है कि यह दर्शाता है, फाइबर लगभग गैर उत्तेजनीय. करने के क्रम में एक बहुत छोटे सक्रिय प्रतिक्रिया (कोई overshoot, चित्रा 5A) बटोर के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए 400nA (0.5ms) के वर्तमान उत्तेजना दालों की जरूरत है. बाहरी Tyrode एक क्लोराइड चैनल ब्लॉकर 9 एसीए के 500 सुक्ष्ममापी युक्त समाधान के प्रतिस्थापन के बाद, 200 NA वर्तमान दालों के लिए एक संभावित कार्रवाई (चित्रा 5B) प्रकाश में लाना करने के लिए पर्याप्त थे, हालांकि बहुत धीमी और नियंत्रण फाइबर में दर्ज की तुलना में व्यापक ( चित्रा 5C). जैसी उम्मीद थी, 9 एसीए के अलावा इस पर नियंत्रण फाइबर (चित्रा 5D) पर न्यूनतम प्रभाव पड़ा.
चित्रा 1 में vivo electroporation पद्धति के अभिकर्मक दक्षता. Brightfield (ए) और प्रतिदीप्ति (बी) एक FDB मांसपेशियों की छवियों PMR mCherry साथ ट्रांसफ़ेक्ट. Electroporation प्रोटोकॉल के बाद दिन: 12 दिन. कृपया संख्या 1 के एक बड़े संस्करण के लिए यहाँ क्लिक करें .
चित्रा 2 अभिव्यक्ति और FDB फाइबर में α-actinin-EGFP का लक्ष्य. ए और बी EGFP प्रतिदीप्ति और एसएचजी छवियों, एक α-actinin EGFP व्यक्त फाइबर के क्रमशः रहे हैं पैनलों. पैनल सी ए और बी पैनलों डी और ई में छवियों के एक superposition है di-8-ANEPPS साथ α actinin EGFP और दाग व्यक्त करते हुए क्रमश: एक और फाइबर के प्रतिदीप्ति छवियों हैं. पैनल एफ विकास और electroporation प्रोटोकॉल के बाद ई. दिन में छवियों के superposition 6 दिन है.
चित्रा 3 अभिव्यक्ति और FDB फाइबर में EGFP DHPRα1s के लक्ष्यीकरण. पैनल ए, EGFP EGFP-DHPRα1s व्यक्त तंतुओं के एक समूह के प्रतिदीप्ति छवि. पैनल बी वर्ग के पैनल में एक इज़ाफ़ा है क्रम में बेहतर प्रोटीन अभिव्यक्ति की बंधी पैटर्न दिखा. पैनल सी एसएचजी पैनल ए पैनल डी में छवि के लिए इसी छवि छवियों के उपरिशायी है एक और सी. पैनल ई पैनल डी. दिन में संकेत दिया electroporation प्रोटोकॉल के बाद क्षेत्र के एक इज़ाफ़ा: 20 दिन.
चित्रा 4 अभिव्यक्ति और FDB फाइबर में EYFP ClC1 के लक्ष्यीकरण. पैनलों A और B EYFP प्रतिदीप्ति और एसएचजी छवियों व्यक्त EYFP - ClC1 फाइबर के क्रमशः रहे हैं. 7 दिनों पैनल सी पैनल ए और बी के पैनल डी एक तीव्रता सफेद electroporation प्रोटोकॉल के बाद पैनल सी. दिन में छवि में डाला रेखा के साथ मापा प्रोफ़ाइल में छवियों के superposition है.
चित्रा 5 electrophysiological मूल्यांकन ट्रांसजेनिक EYFP ClC1 पैनलों. व्यक्त फाइबर ए और बी एक फाइबर से वर्तमान दालों के जवाब में EYFP ClC1 9 एसीए के साथ इलाज के पहले और बाद में व्यक्त क्रमशः वोल्टेज रिकॉर्ड कर रहे हैं. पैनलों सी और डी एक गैर ट्रांसफ़ेक्ट फाइबर में वर्तमान दालों के जवाब में वोल्टेज रिकॉर्ड हासिल (कार्रवाई क्षमता) से पहले और बाद में 9 एसीए के साथ उपचार, क्रमशः.
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Discussion
हम यहाँ विस्तृत कदम का वर्णन है कि क्रम में कंकाल की मांसपेशी फाइबर में द्वारा vivo electroporation में डीएनए plasmids के प्रभावी transfections प्राप्त पालन किया जाना चाहिए . हमारे दृष्टिकोण का मुख्य लाभ के कार्यान्वयन की सादगी, और अपने न्यूनतम invasiveness नगण्य स्वास्थ्य जानवरों के लिए खतरा में जो परिणाम हैं. हकीकत में, ऊपर वर्णित electroporation प्रोटोकॉल ज्यादा दो फुट प्रति उपचर्म इंजेक्शन, एक बिजली की उत्तेजना प्रोटोकॉल है, जो सभी के संज्ञाहरण के तहत पशुओं द्वारा अच्छी तरह से सहन के द्वारा पीछा किया से अधिक नहीं पड़ेगा. हमारी संस्था में इन जोड़तोड़ पूरी तरह गैर सर्जिकल प्रक्रियाओं हो सकता है क्योंकि वे त्वचा के उद्घाटन के शामिल नहीं है निर्धारित कर रहे हैं. इसके अलावा, electroporation प्रक्रियाओं की दयालुता एक कुशल प्लाज्मिड अभिकर्मक और मांसपेशी फाइबर द्वारा बाद में प्रोटीन अभिव्यक्ति प्राप्त है के बाद से किसी भी महत्वपूर्ण कोशिका क्षति उनकी कुशलता से सक्रिय प्रोटीन संश्लेषण में संलग्न करने की क्षमता क्षीण होता समग्र सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है.
यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं के लिए मामूली समायोजन हो सकता है (और किया गया है) माउस पैर (जैसे extensor digitorum longus, EDL, tibialis पूर्वकाल, टीए, और, soleus मांसपेशियों) के बड़े मांसपेशियों के लिए लागू कर सकते हैं. इसके अलावा, बस डीएनए की कुल राशि स्केलिंग द्वारा, हम सही क्रम में यहाँ वर्णित है महान सफलता के साथ वयस्क चूहों के FDB और कब मांसपेशियों transfect प्रक्रियाओं को लागू किया है.
हालांकि अभिकर्मक प्रोटोकॉल लगातार मांसपेशी फाइबर द्वारा ट्रांसजेनिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति का एक चर स्तर में परिणाम के लिए, इस का लाभ लिया जा सकते हैं और शारीरिक प्रयोगों में, गैर व्यक्त फाइबर नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और अभिव्यक्ति के विभिन्न स्तर के साथ फाइबर के लिए सहसंबंधी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है समारोह परिवर्तन के स्तर के साथ अभिव्यक्ति के स्तर. इसके अलावा, सीएमवी प्रमोटरों प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर है, अन्य मांसपेशियों विशिष्ट प्रमोटरों प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्रभावकारिता में सुधार हो सकता है उपज में उपयुक्त हो पाया गया है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जब यह संभव नहीं है (या सुविधाजनक) fluorescently टैग मांसपेशी फाइबर में प्रोटीन constructs व्यक्त करने के लिए, हम untagged प्रोटीन को व्यक्त करने में सफल रहा है और bicistronic plasmids कि एक साथ एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन सांकेतिक शब्दों में बदलना के साथ अभिव्यक्ति के स्तर की निगरानी.
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Acknowledgments
हम हमारे साथ TPLSM सुविधा साझा करने के लिए, तंत्रिका जीव विज्ञान, UCLA के विभाग, डॉ. टी. ओटिस धन्यवाद, डॉ. सी. Fahlke, फिजियोलॉजी संस्थान, RWTH आकिन, जर्मनी, pEYFP - ClC1 प्लाज्मिड की तरह दान के लिए, और श्री तकनीकी सहायता के लिए आर. Serrano. इस काम के NIH / NIAMS AR047664 और AR54816 अनुदान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
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