使用哺乳动物骨骼肌的DNA转染在体内电穿孔
Summary
我们描述了使用电和随后的可视化的表达蛋白，用荧光显微镜活体小鼠的脚部肌肉纤维的高效转染质粒DNA的详细程序。
Abstract
在细胞生物学中的一个越来越大的兴趣，是为了表达transgenically修改必需的蛋白质（如荧光标记的结构和/或突变的变种）的形式，以调查他们的内源性的分布和功能的相关性。一个有趣的方法，已实施完成这个目标，在完全分化的细胞是<em>在体内</em>通过各种方法进入特定组织，如肝质粒转染<sup> 1</sup>，骨骼肌<sup> 2,3</sup>，甚至大脑<sup> 4</sup>。我们在座的详细描述，以便有效地转染到纤维的遗传物质，必须遵循的步骤<em>趾短屈肌</em>（FDB）<em> interosseus</em（IO）的成年小鼠的肌肉，使用<em>在体内</em>电击方法。实验参数进行了优化，从而最大限度地转，同时尽量减少组织损伤，可能会损害个别纤维表达的蛋白质的质量和数量的肌纤维的数量。我们已经验证了本文中所描述的方法实施中的可溶性蛋白的高收益，即EGFP和ECFP结果<sup> 3</sup>，蛋白酶，FKBP12的，β2aDHPR等;结构蛋白，即minidystrophin和α-辅肌动蛋白和膜蛋白，即α1sDHPR，RYR1，心脏钠/ CA<sup> 2 +</sup>换热器，钠通道，SERCA1 NaV1.4等，当应用FDB，IO和其他肌肉的小鼠和大鼠。一些这些蛋白质的高效表达，得到了验证与生化<sup> 3</sup>和功能的证据<sup> 5</sup>。然而，迄今为止我们所使用的最常见的验证方法是标准的荧光显微镜和双光子激光扫描显微镜（TPLSM），许可证标识不仅是整体的表达，而且还详细的细胞内定位荧光标记的蛋白质结构。该方法同样可以被用于转染的生理相关的蛋白质的表达质粒编码（如下所示），或旨在干扰RNA（siRNA）抑制正常表达的蛋白质的表达（不是由我们尚未测试）。应该指出，转FDB和IO肌纤维，特别是哺乳动物的肌肉生理学调查有关，因为这些肌肉酶分离的纤维是目前最适合的车型之一，调查的兴奋性和兴奋收缩偶联的基本机制下电流或电压钳条件<sup> 2,6-8</sup>。
Protocol
Discussion
我们在这里描述应当遵循的，为了达到有效的DNA质粒转染骨骼肌纤维在体内电的详细步骤。我们的方法的主要优点是实现简单，其最小的侵袭，在对动物的健康危害可以忽略不计结果。在现实中，上面介绍的电协议不涉及两个皮下注射每英尺，通过电刺激的协议，所有这一切都是在麻醉状态下的动物的耐受性良好，远远高于。在我们的机构，这些操作是完全确定的非手术的程序，因为它们?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢T.奥的斯，博士，加州大学洛杉矶分校神经生物学系，与我们一起分享TPLSM设施，三Fahlke博士，生理研究所，德国亚琛工业大学，，pEYFP ClC1质粒的捐赠，和先生R.塞拉诺为技术支持。这项工作是由来自美国国立卫生研究院/ NIAMS补助AR047664和AR54816的赠款支持。
References
- Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery. Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers. J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).
- DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system. Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).
- Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons. Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle. Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).
- Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres. J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).
- DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).
- Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy. J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).
- Zipfel, W. R. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).
- Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres. Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).
- DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS. J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).
- Mills, M. Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy. Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).
- Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres. J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).
