使用して哺乳類の骨格筋のDNAトランスフェクションインビボでのエレクトロポレーション
Summary
我々は、エレクトロポレーションと蛍光顕微鏡を用いたタンパク質発現のその後の可視化を使用して、生きたマウスの足の筋肉の繊維へのプラスミドDNAの効率的なトランスフェクションのための詳細な手順を説明します。
Abstract
細胞生物学への関心の高まりは、内因性の分布と機能的関連性を調べるために必須のタンパク質（例えば、蛍光標識の構造及び/または突然変異体）の遺伝子導入によって修飾された形態を発現させることである。完全に分化した細胞ではこの目的を達成するために実装されている面白いアプローチです<em> in vivoで</em肝臓などの特定の組織への様々な方法により、プラスミドの>トランスフェクション<sup> 1</sup>、骨格筋<sup> 2,3</sup>、とさえ脳<sup> 4</sup>。ここでは、効率の繊維に遺伝物質をトランスフェクトするために従わなければならない手順の詳細な説明を提示する<em>短趾屈筋</em>（FDB）と<em>骨間</em使用して成体マウスの>（IO）の筋肉<em> in vivoで</em>エレクトロポレーションアプローチ。実験パラメータは、個々の繊維で発現されるタンパク質の質と量を損なうおそれがある組織の損傷を最小限に抑えながら、トランスフェクトされた筋線維の数を最大化するように最適化されています。我々は、このホワイトペーパーで説明されている方法論の実装では、可溶性タンパク質の高収率、すなわち、EGFPおよびECFPをもたらすことが確認されました。<sup> 3</sup>、カルパイン、FKBP12、β2a- DHPR、等、構造タンパク質、すなわちminidystrophinとα-アクチニン、および膜タンパク質、すなわちα1s- DHPR、RyR1、心臓のNa / Ca比<sup> 2 +</supFDB、IOとマウスやラットの他の筋肉に適用される>交換器、NaV1.4ナトリウムチャネル、SERCA1、等、。これらのタンパク質のいくつかの効率的な発現は、生化学的に検証されています<sup> 3</sup>と機能的な証拠<sup> 5</sup>。しかし、はるかに私達が使用する最も一般的な確証的なアプローチは、蛍光標識蛋白質の構造の標準的な蛍光顕微鏡と2光子レーザー走査顕微鏡（TPLSM）、全体の式ではないだけを識別できるだけでなく、詳細な細胞内局在はです。方法は、均等に（ここに示すように）生理的関連性のタンパク質の発現をコードするプラスミドをトランスフェクトするために使用、または干渉RNA（siRNA）のため、通常は発現されるタンパク質（まだ私たちでテストされていない）の発現を抑制することを目指してすることができます。それはこれらの筋肉から酵素的に解離繊維が下の興奮性と興奮収縮カップリングの基本的なメカニズムを調べるために現在最も適切なモデルの一つであるため、FDBとIO筋線維のトランスフェクションは、哺乳類の筋肉の生理学の研究に特に関連であることに注意する必要があります電流または電圧クランプ状態<sup> 2,6-8</sup>。
Protocol
Discussion
ここでは、in vivoでのエレクトロポレーションのことで骨格筋線維へのDNAプラスミドの効果的なトランスフェクションを達成するために従わなければならない詳細な手順を説明します。我々のアプローチの主な利点は、動物にごくわずかの健康被害をもたらすの実装のシンプルさ、そしてその最小限の侵襲です。現実には、上述のエレクトロポレーションプロトコルは、麻酔下の…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私達は私達とTPLSM施設を共有するために博士T.オーティス、神経生物学、UCLAの部、感謝、博士C. pEYFP – ClC1プラスミドの種類の寄付のためのFahlke、生理学研究所、アーヘン工科大学、ドイツ、、と氏技術サポートのため。R.セラーノ。この作品は、NIH / NIAMS助成AR047664とAR54816からの補助金によって支えられている。
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