Transfecção de DNA de mamíferos usando músculos esqueléticos In Vivo Eletroporação
Summary
Descrevemos os procedimentos detalhados para a transfecção eficiente de DNA plasmidial nas fibras dos músculos do pé de ratos ao vivo usando o eletroporação ea visualização posterior de expressão da proteína através de microscopia de fluorescência.
Abstract
A crescente interesse em biologia celular é a de expressar formas transgenicamente modificado de proteínas essenciais (por exemplo, constrói fluorescente etiquetado e / ou variantes mutantes), a fim de investigar sua distribuição endógenos e relevância funcional. Uma abordagem interessante que foi implementada para cumprir este objectivo em células totalmente diferenciadas é o<em> In vivo</em> Transfecção de plasmídeos por vários métodos em tecidos específicos, tais como o fígado<sup> 1</sup> Muscular, esquelético<sup> 2,3</sup>, E até mesmo o cérebro<sup> 4</sup>. Apresentamos aqui uma descrição detalhada dos passos que devem ser seguidas a fim de transfecção eficiente material genético nas fibras do<em> Flexores dos dedos brevis</em> (FDB) e<em> Interósseos</em> (IO) músculos de camundongos adultos usando um<em> In vivo</em> Abordagem eletroporação. Os parâmetros experimentais foram optimizados de forma a maximizar o número de fibras musculares, minimizando os danos transfectadas tecido que pode prejudicar a qualidade ea quantidade das proteínas expressas em fibras individuais. Temos verificado que a implementação da metodologia descrita neste trabalho resulta em um alto rendimento de proteínas solúveis, ou seja EGFP e ECFP<sup> 3</sup>, Calpaína, FKBP12, β2a-DHPR, etc; proteínas estruturais, ou seja minidystrophin e α-actinina e proteínas da membrana, ou seja α1s-DHPR, RYR1, cardíacas Na / Ca<sup> 2 +</sup> Trocador, NaV1.4 Na canal, SERCA1, etc, quando aplicada a FDB, IO e outros músculos de camundongos e ratos. A expressão eficiente de algumas dessas proteínas tem sido verificado com bioquímicas<sup> 3</sup> E provas funcionais<sup> 5</sup>. No entanto, de longe, a abordagem mais comum de confirmação utilizados por nós são de microscopia fluorescente padrão e dois fótons de microscopia de varredura a laser (TPLSM), que permitem identificar não apenas a expressão geral, mas também a localização detalhada intracelular, de construções de proteína fluorescente etiquetado. O método poderia ser igualmente utilizado para transfecção de plasmídeos que codificam para a expressão de proteínas de relevância fisiológica (como mostrado aqui), ou por interferência de RNA (siRNA) com o objetivo de suprimir a expressão de proteínas normalmente expressa (não testado por nós até o momento). Note-se que a transfecção de fibras musculares FDB e IO é particularmente relevante para a investigação da fisiologia de mamíferos desde que as fibras musculares enzimaticamente dissociada estes músculos são atualmente um dos modelos mais adequados para investigar os mecanismos básicos de acoplamento excitabilidade e excitação-contração em corrente ou tensão condições clamp<sup> 2,6-8</sup>.
Protocol
Discussion
Descrevemos aqui os passos detalhados que devem ser seguidas a fim de atingir transfections eficaz de plasmídeos de DNA em fibras musculares esqueléticas em por eletroporação in vivo. As principais vantagens da nossa abordagem são a simplicidade de implementação, e sua mínima invasividade que resulta em perigo para a saúde negligenciável para os animais. Na realidade, os protocolos acima descritos eletroporação não implicam muito mais do que duas injeções subcutâneas por pé, seguido po…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. T. Otis, Departamento de Neurobiologia, UCLA, para compartilhar as instalações TPLSM conosco, Dr. C. Fahlke, Instituto de Fisiologia, RWTH Aachen, Alemanha, para o tipo de doação o plasmídeo pEYFP-ClC1, eo Sr. . R. Serrano para suporte técnico. Este trabalho foi suportado por concessões do NIH / NIAMS concede AR047664 e AR54816.
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