DNA Transfektion av däggdjurs Skelettmuskulatur hjälp In Vivo Elektroporation

Summary

Vi beskriver detaljerade förfaranden för effektiv transfektion av plasmid-DNA i fibrerna av mul muskler av levande möss med elektroporation och den efterföljande visualisering av protein uttryck med hjälp av fluorescensmikroskopi.

Abstract

Ett växande intresse för cellbiologi är att uttala transgenically modifierade former av viktiga proteiner (till exempel fluorescerande taggade konstruerar och / eller mutant varianter) för att undersöka deras endogena distribution och funktionell relevans. En intressant metod som har genomförts för att uppfylla detta mål fullt differentierade celler är<em> In vivo</em> Transfektion av plasmider med olika metoder i specifika vävnader såsom lever¹, Skelettmuskel^2,3, Och även hjärnan⁴. Vi presenterar här en detaljerad beskrivning av de steg som måste följas för att effektivt transfektera genetiskt material in i fibrerna i<em> Flexor digitorum brevis</em> (FDB) och<em> Interosseus</em> (IO) musklerna i vuxna möss med hjälp av en<em> In vivo</em> Elektroporation tillvägagångssätt. Den experimentella parametrar har optimerats för att maximera antalet muskelfibrer transfekterade samtidigt minimera vävnad skador som kan försämra kvaliteten och kvantiteten av de proteiner som uttrycks i enskilda fibrer. Vi har kontrollerat att genomförandet av den metod som beskrivs i detta dokument ger en hög avkastning av lösliga proteiner, dvs EGFP och ECFP³, Calpain, FKBP12, β2a-DHPR, etc. strukturella proteiner, dvs minidystrophin och α-actinin, och membranproteiner, dvs α1s-DHPR, RyR1, hjärt-Na / Ca^{2 +} Värmeväxlare, NaV1.4 Na kanal SERCA1 etc. när de appliceras på FDB, IO och andra muskler av möss och råttor. Den effektiva av några av dessa proteiner har verifierats med biokemiska³ Och funktionella bevis⁵. Men den i särklass vanligaste bekräftande metod som används av oss är vanliga lysrör mikroskopi och 2-fotonen laserskanning mikroskopi (TPLSM), som tillåter att identifiera inte bara de övergripande uttryck, men också den detaljerade intracellulär lokalisering av fluorescerande taggade proteinet konstruktioner. Metoden skulle kunna vara lika användas för att transfektera plasmider kodning för uttrycket av proteiner av fysiologiska betydelsen (som här), eller för störningar RNA (siRNA) som syftar till att undertrycka uttryck uttrycks normalt proteiner (ej testade av oss ännu). Det bör noteras att transfektion av FDB och IO muskelfibrer är särskilt relevant för utredningen av däggdjur muskelfysiologi sedan fibrer enzymatiskt tagit avstånd från dessa muskler är idag en av de mest lämpliga modeller för att undersöka grundläggande mekanismer retbarhet och excitation-kontraktion koppling i ström eller spänning klämma villkor^2,6-8.

Protocol

Experimentella Rutiner för in vivo-elektroporering i FDB och IO muskler Innan in vivo elektroporering protokoll måste däggdjur uttryck plasmider förstärkas för att ge koncentrationen i intervallet på 2-5 mikrogram plasmid / l av TE. OBS: Vi rutinmässigt använder kommersiella förstärkning kit och följ tillverkarens förfaranden. Kommersiella uttryck plasmider som bär CMV promotor fungerar mycket bra i skelettmuskulatur in vivo transfections. Alikvotera nödvän…

Discussion

Vi beskriver här de detaljerade steg som bör följas för att uppnå en effektiv transfections av DNA plasmider i skelettmuskulaturen fibrer av in vivo-elektroporering. De största fördelarna med vår strategi är enkelheten i genomförandet, och dess minimala invasiv vilket resulterar i försumbar hälsorisk för djuren. I verkligheten innebär de ovan beskrivna elektroporation protokollen inte mycket mer än två subkutana injektioner per fot, följt av en elektrisk stimulering protokoll, som alla är väl…