Summary
Este protocolo describe el aislamiento y la posterior expansión de células mesenquimales del estroma y las células endoteliales que forman colonias sin el uso de suero animal para generar pares con fines de trasplante autólogo experimental.
Abstract
El cordón umbilical es una fuente rica de células progenitoras con un alto potencial de proliferación de células mesenquimales del estroma incluyendo (también llamados células madre mesenquimales, MSC) y endoteliales que forman colonias células progenitoras (ECFCs). Ambos tipos de células son actores clave en el mantenimiento de la integridad de los tejidos y es probable que también participan en los procesos de regeneración y la formación de tumores.
Para el estudio de su biología y su función en forma comparativa, es importante tener los dos tipos de células disponibles de un mismo donante. También puede ser beneficioso para los propósitos de regeneración para obtener CMM y ECFCs del mismo tejido.
Debido a que la terapéutica celular finalmente debe encontrar su camino desde el laboratorio a la cabecera se estableció un nuevo método para aislar y expandir las células madre sin el uso de proteínas de origen animal. Lisado de plaquetas humanas agrupados (pHPL) reemplazó suero fetal bovino en todas las etapas de nuestro protocolo de evitar por completo el contacto de las células a las proteínas xenogénicas.
Este vídeo muestra una metodología para el aislamiento y la expansión de las células progenitoras del cordón umbilical de uno.
Todos los materiales y los procedimientos se describen.
Protocol
Parte 1: Configuración
1. Preparación del medio de cultivo celular
Antes de iniciar la preparación a medio recoger todos los materiales y las herramientas que usted necesita.
Descongele 2 x 56 ml alícuotas de lisado de plaquetas humanas agrupados (pHPL, hecho a sí mismo: una referencia y JoVe # 1523), 10 ml de penicilina 100x / solución de estreptomicina, 2 x 5 ml de L-glutamina (Sigma dos).
Descongele las citoquinas y las alícuotas del factor de crecimiento (VEGF, bFGF, EGF, IGF, hidrocortisona, ácido ascórbico, la heparina, la anfotericina siempre como "quots único"), ajustado para complementar una botella (500 ml) de medio EGM-2 (Lonza).
De la nevera tomar una botella de 500 ml cada uno de (i) la alfa-modificado medio mínimo esencial (a-MEM) y (ii) el medio basal endotelial (EBM).
Todos los pasos siguientes se llevan a cabo en una campana de flujo laminar de cultivo de tejidos en condiciones estériles.
Prepare la heparina sin conservantes (por ejemplo, Biochrom) disolviendo el polvo a una concentración final de 1000 UI / ml con agua estéril.
MSC-Media:
Utilizar 500 ml de una MEM, añadir 56 ml de descongelado pHPL (véase también la referencia 1 para más detalles) e IU 2 / ml (= l de solución madre 224) de la heparina sin conservantes (evita la coagulación del medio a través de la formación de grumos el fibrinógeno en el plasma) para alcanzar una concentración final del 10% pHPL. Además añade la penicilina (100U/mL) / estreptomicina (100μg/mL) y la solución 2 mM de L-glutamina (Sigma ambos).
Filtrar el medio a través de 20 micras de poro del filtro de vacío de tamaño (Millipore). Etiqueta de la botella adecuadamente (contenido, la fecha).
ECFC-Media:
Utilice una botella (500 ml) de la MBE, añadir las alícuotas de citoquinas, 56 ml de pHPL, 10 UI / ml (= 1120μl de la solución madre) sin conservantes heparina, penicilina (100U/mL) / estreptomicina (100 g / ml) y 2 mM de L-glutamina en el medio basal y el filtro con 20 l-de tamaño de poro del filtro de vacío (Millipore). Etiqueta de la botella adecuadamente (contenido, la fecha).
2. La esterilización de instrumentos quirúrgicos
Pinzas, tijeras afiladas quirúrgica y titular de bisturí debe ser el calor esterilizados desechables mineral estéril.
3. Preparación de los tubos de recogida de cable
Añadir 500 UI de conservantes - heparina libre de 50 tubos de polipropileno ml (Falcon) y adaptarse a un volumen final de 20 ml con PBS. La transferencia de los tubos en la sala de partos.
4. El consentimiento informado (confirmado por el comité de ética local o IRB).
Pregunte a los padres antes de la entrega si desea donar un pedazo de la cuerda y les informará adecuadamente de los efectos que va a servir.
5. Cable de donación
Después de la entrega y la inspección de la placenta y el cordón cortado un pedazo de 10 cm y de inmediato se traslado al tubo precargada con heparina para evitar la coagulación de la sangre que queda dentro de los vasos del cordón umbilical. Continuar con el aislamiento de células tan pronto como sea posible.
Parte 2: el aislamiento de células
- Prepare campana de flujo laminar el tejido cultural de la limpieza de superficies con INDICIN o 70% EtOH. Lugar estéril de 150 cm 2 placas de cultivo celular, 75 cm frascos de cultivo celular (tanto Corning), PBS, se esterilizan los instrumentos quirúrgicos, raspadores de células, soporte de tubo de 25 ml stripettes y jeringas de 5 ml equipado con agujas de punta roma adecuadamente en su campana limpia.
- Pre-caliente el preparado α-MEM y el EGM-2 medio de cultivo celular de 37 ° C en un baño de agua.
- Traiga la cuerda de la sala de partos para su laboratorio equipado con la capucha de cultivo de células. Después de transferir el cable en el flujo laminar que lavar dos veces en PBS (por transferencia a una nueva placa) para deshacerse de la contaminación de las células sanguíneas. Enjuague la vena umbilical después del canulating que por un lado con una jeringa de 5 ml estéril equipado con una aguja de punta roma con PBS hasta que el líquido que sale del otro extremo del cable está completamente transparente (rojo indica contaminación de la sangre).
ECFCs:
- Prepare un frasco de 75 cm2 (Corning), se etiqueta y rellenar 15-20 ml de pre-calentado medio EGM-2.
- Coloque el cable en una nueva placa llena de PBS estéril.
Tome las tijeras quirúrgicas y cortar el cordón umbilical en dos trozos de unos 5 cm de longitud (piezas cortas son más fáciles de procesar, porque los vasos umbilicales se retuercen a lo largo de su eje). - Trate de encontrar la vena umbilical (vaso grande), insertar una hoja de las tijeras quirúrgicas y cortar la vena longitudinal. En este punto podría ser útil que un ayudante puede mantener la vena ya cortado con dos pinzas, mientras que reducir aún más.
- Coloque el pastel de la médulace con el corte de vena en una nueva placa sin PBS, tomar el rascador de células y roce de la parte interna (endotelio) de superficie de la vena umbilical por frotamiento de una punta a la otra. Transferencia de las células de su frasco preparado por la limpieza de la punta de la espátula en el medio. Repita este procedimiento por lo menos 10 veces.
- Cerca de su frasco y ponerlo en una incubadora (37 ° C, 5% CO2, 95% de humedad).
MSC:
- Preparar a 150 cm 2 placas de cultivo (Corning) y la etiqueta de la misma.
- Tome el trozo de cordón (después de extraer la capa endotelial) y cortar el cordón todo en trozos muy pequeños mediante el uso de tijeras estériles y bisturí estéril. El tamaño máximo de las piezas de cable debe ser de 1-2 mm.
- La transferencia de sus piezas cable con la pinza estéril en su placa de cultivo de pre-etiquetados. Al dejar abierta la placa durante 5 minutos antes de llenar con el medio, la fijación de las piezas a la superficie de plástico se fortalece.
- Una vez que las piezas de cable están conectados adecuadamente a las de plástico, añadir con cuidado en 30-35 ml de pre-calentado alfa modificado MEM. Trate de usar la velocidad más baja para asegurarse de que todas las piezas de permanecer unidos.
- Cerrar la placa y ponerla en una incubadora (37 ° C, 5% CO2, 95% de humedad).
Parte 3: la expansión celular y la confirmación de la inmuno-fenotipo por citometría de flujo
La expansión de células
EFCFs:
- Compruebe la conexión de las células endoteliales al día siguiente en un microscopio invertido y el intercambio de toda EGM-2 medio para deshacerse de todas las células no inscritos y las partículas.
- Expandir las células hasta que un paso, de intercambio tercio de la media dos veces por semana. Cuando se llega a la confluencia, separar las células con el 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA y transferirlos a los buques de nueva cultura. Dependiendo del número de células dentro de su frasco T75, usted debe elegir el tamaño y el número de sus nuevos frascos para garantizar la densidad de siembra de baja para una mayor expansión.
- Cambio de un tercio de la media dos veces por semana durante la expansión de las células.
MSC:
- El resultado de las MSC del cordón se tomará más tiempo, así que usted puede esperar por lo menos 3-4 días hasta que compruebe en un microscopio invertido para la aparición de células fusiformes en los alrededores de las piezas de tejidos conectados. Cuando no hay suficientes células de crecimiento, las piezas tienden a separarse debido a que pierden contacto con el plástico.
- Después de 10-12 días retirar las piezas de tejidos, separar las MSC del plástico con 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA y transferirlos a los buques de nueva cultura. Dependiendo de la cantidad de células dentro de su plato debe decidir el tamaño y el número de sus nuevos frascos para garantizar la baja densidad de siembra para una mayor expansión.
- Cambio de un tercio de la media dos veces por semana durante la expansión de las células.
Citometría de flujo
Material necesario:
Citómetro de flujo (BD FACSCalibur), micrónico tubos (Corning), soporte para tubos, suero de oveja (bloqueo de reactivo), Eppifuge (Eppendorf), los anticuerpos monoclonales
MSC: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, controles de isotipo
ECFCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, controles de isotipo
- Después de llegar a la confluencia, separar la celda con un 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA y se centrifuga a 300 g durante 7 min a 4 ° C.
- Resuspender las células a una concentración de 1x10 6 células / ml en PBS modificado y la unión de bloques de anticuerpos inespecíficos con 10% v / v de suero de oveja durante 20 min a 4 ° C.
- Marque los tubos Micronic y añadir la concentración adecuada de anticuerpos fluorescentes etiquetados.
- Añadir 50 l de suspensión celular (bloqueadas) a cada tubo y se incuba durante 30 min a 4 ° C.
- Lavar las células modificadas mediante la adición de PBS para eliminar los anticuerpos no son vinculantes.
- Vaya con su celda marcada con el citómetro de flujo y realizar el análisis.
Parte 4: crecimiento ECFC colonia, fijación, tinción y análisis de la jerarquía
- Semilla de la ECFCs prácticamente puro cosechado en la densidad de placas muy baja de 3 o 10 células por centímetro cuadrado en placas de cultivo celular para permitir el crecimiento de colonias individuales.
- Cambio de un tercio de la media dos veces por semana.
- Después de 14 días (fin de la cultura) eliminar medio, lavar dos veces con PBS y fijar las colonias con la solución de fijación fría (acetona: metanol = 3: 2) durante 15 minutos en el refrigerador.
- Deseche la solución de fijación y dejar las placas abiertas a secar por 10 minutos.
- Rehidratar las células con agua destilada durante 10 minutos.
- Añadir Harris solución Tinción de hematoxilina las colonias fija durante 12 minutos.
- Quitar H solución matoxylin y enjuague los platos con agua del grifo para eliminar la solución de tinción restantes.
- Tomar fotos de cada coloniautilizando un microscopio estereoscópico y la importación *. jpg o *. tif en su ordenador.
- Abra las fotos con el software ImageJ y analizar el número de células precisa de cada colonia como se describe en la animación.
- Abra el software ImageJ e importar una imagen de la colonia con el 'Archivo \ Abrir' función en el menú desplegable.
- Proceder con el "Proceso \ Antecedentes Reste" función
- Utilice la función de "selección elíptica * * o cepillo" en el menú de ImageJ para marcar el margen de colonia.
- Borrar la imagen circundante a través del "Editar \ Fuera de Clear 'función y recortar la imagen, seleccionando" Recortar \'.
- Ajuste el umbral de forma manual utilizando el 'Imagen \ Ajuste de Umbral \' función, por lo que todas las células son completamente de color rojo.
- Cuente el número de células de la colonia mediante la selección de "Analizar \ Analizar las partículas. Elegir la configuración adecuada (optimizado para cada tipo de célula) y seleccione "Aceptar". El cuadro de resultados, incluyendo el recuento de células y una nueva imagen que contiene los lineamientos correspondientes de las células contadas aparecerá.
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Discussion
Hay una variedad de fuentes de donde obtener MSC o ECFCs incluyendo la médula ósea, el tejido adiposo, sangre del cordón umbilical, etc
Es necesario tener ambos tipos de células progenitoras de la misma fuente para comparar directamente la participación de los diferentes tipos de células en procesos como la regeneración de los tejidos y vasos o contribución a la progresión del tumor.
La facilidad con que para aislar y posteriormente estudio pares autólogo de ECFCs y las MSC del mismo donante hace que este método ventajoso para la exclusión de las variaciones de los donantes en los experimentos individuales.
Posible contaminación con las células hematopoyéticas se reduce al mínimo a través de un paso de pases y se confirma con la citometría de flujo.
Si se hace correctamente, las células aisladas debe (i) comparten características de las células progenitoras, (ii) esté disponible para el trasplante experimental en cantidades suficientes y (iii) ser puro según lo confirmado por citometría de flujo.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Katharina Schallmoser para proporcionar pHPL, Rohde y Eva Nicole Hofmann por sus valiosos comentarios al manuscrito, Daniela P. Thaler y Margaretha hwirth de asistencia técnica, Mónica Farrell para la edición de lingüística, Uwe Lang, Holzapfel Margit y Sandra Eppich al Departamento de Obstetricia para proporcionar las cuerdas.
Este trabajo ha sido financiado por el Austrian Research Foundation (FMF, la concesión N211-NAN para DS), la Agencia de Promoción de la Investigación de Austria (FFG, otorgar N200 para DS) y por el adulto de células madre de Investigación (AR). AR es un compañero de la medicina molecular programa de doctorado de la Universidad Médica de Graz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha modified MEM | Sigma-Aldrich | ||
| L-GLutamin | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | ||
| EBM | Lonza Inc. | ||
| Single cytokine quots | Lonza Inc. | ||
| 75 cm2 flasks | Corning | ||
| 150 cm2 plates | Corning | ||
| Cell scraper | Corning | ||
| Trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Monoclonal antibodies | BD Biosciences | ||
| PBS | |||
| 50 ml tubes | Falcon BD | ||
| 500 mL filter 20 μm pore size | EMD Millipore | ||
| Preservative free heparin | Biochrom AG |
References
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Strunk, D. Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy. Transfusion. 45, 315-326 (2005).
