可视化的单分子荧光显微镜下的DNA复制

Summary

此协议表明一个简单的可视化实时个人replisomes的DNA复制的单分子荧光显微镜技术。

Abstract

我们描述了一个简单的基于荧光显微镜实时的方法，在单分子水平上观察DNA的复制。一个圆形，分叉的DNA为模板，连接到一个官能的玻璃盖玻片和广泛复制后，引进复制的蛋白质和核苷酸（图1）。增长的产品双链DNA（dsDNA）的扩展与层流，通过使用嵌入染料的可视化。测量实时日益增长的DNA末端的位置，允许复制率精确测定（图2）。此外，完成DNA产品的长度报告上的复制processivity。这个实验可以很容易和迅速地执行，只需要一个相当敏感的相机的荧光显微镜。

Protocol

执行单分子的复制实验之前，一些材料需要提前做好准备。

1。 DNA复制模板

复制反应的底物是生物素标记，尾M13的滚动一圈，准备使用标准的^分子生物学技术1,2。

材料：M13mp18单链DNA，生物素的尾巴寡核苷酸引物（5' -生物素- _T的36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT - 3“），T7 DNA聚合酶，加 ​​热块，苯酚/异戊醇/氯仿

1. 加入10倍，超过TBS缓冲液（330牛尾巴寡，33纳米M13）的寡核苷酸，退火的生物素标记的尾巴寡核苷酸的M13。
2. 加热至65 ° C在加热块的混合物。加热后，打开热封锁，并允许缓慢冷却，以正确的引物退火。
3. 催芽M13的64纳米T7 DNA聚合酶和T7复制缓冲区含有dNTPs和MgCl _2的混合物。
4. 孵育反应在37 ° 12分钟，并与100毫米EDTA淬火。
5. 净化填充产品的DNA，酚/氯仿/异戊醇提取到TE缓冲液透析或其他合适的存储缓冲区，并确定DNA浓度（返回提取每个恢复催芽M13的任何残余的有机相）。
6. 一个模板制备的迭代可以很容易地使纳摩尔浓度模板的几毫升，足够几百到成千上万的单分子实验。

2。官能盖玻片

用于连接的DNA玻璃盖玻片，玻璃是先与氨基硅烷，然后再加以生物素化的聚乙二醇分子官能。这种涂层有助于减少和DNA复制蛋白的非特异性相互作用与表面^1,3。

材料：盖玻片，染色罐，3 -氨丙基甲氧基PEG5k - NHS酯，生物素，PEG5k NHSester，丙酮，1M氢氧化钾，乙醇，烤箱，浴sonicator

1. 彻底清洁玻片，放置在染色罐和灌装的罐子，用乙醇。超声30分钟，冲洗出来的罐子和填充用1 M KOH。超声30分钟重复洗。
2. 第一官能反应，所有的水的痕迹需要被删除。填写的罐子，用丙酮和10分钟的超声。再次用丙酮冲洗罐。
3. 准备的硅烷丙酮试剂的2％V / V解决方案。添加到染色罐，搅拌2分钟。这种反应夫妇烷氧基氨基硅烷在玻璃集团，留下了对未来的耦合步骤的反应胺。淬火的大量过剩与水的反应。
4. 他们在30分钟的烤箱在110℃烘烤干燥的盖玻片。
5. 准备一个50:1的甲氧基：在100毫米_碳酸氢钠 3 pH值8.2生物素聚乙二醇的混合物。旨在为约0.2％W / V的生物素化的聚乙二醇。
6. 吸取100μL，到干硅烷盖玻片和另一盖玻片上顶部的PEG混合物。其中包括一个玻璃盖玻片间隔将使分离的盖玻片。
7. 在3小时的PEG解决方案孵育盖玻片，然后单独每对盖玻片，用清水洗净广泛。要注意保持官能盖玻片的一面朝上只有一次方将涂用PEG。
8. 干在真空状态下的盖玻片和存储。至少一个月的表面保持稳定，使盖玻片数十可以在一个批次，并根据需要使用。

这些材料应提前，然后使用每个实验。要启动每单分子实验，开始组装流室。

3。流室准备

这项实验是使用官能盖玻片，双面胶带，石英片和管构造一个简单的流室。一个流室，准备为每个单分子实验^1,4。

材料：双面胶带，刀片，与孔管，快干环氧石英片，官能盖玻片（见上文），链解决方案（1毫克/毫升的PBS 25μL），油管，封闭液（20毫米三pH值7.5，2毫米EDTA，50毫米氯化钠，0.2 mg / mL的BSA，0.005％Tween - 20的）

1. 首先在干燥器中放置封闭液20-25毫升，为后面的步骤中删除任何气泡。
2. 采取的PEG -官能盖玻片，PBS稀释的链霉亲和解决方案的125个分布在表面。离开这个孵育20分钟，同时准备室的其他部位，使链霉亲和绑定表面biotins。
3. 剪下一块双面ð磁带的石英片的大小相匹配。马克磁带上的油管用铅笔绘制孔，使流室的轮廓，可以在磁带上（1毫克/毫升）位置。
4. 使周围的孔2毫米宽的矩形。这将作为流动通道，所以一定要管的入口和出口直边和周围留有余地。如果需要，多渠道或不同大小都可以使用。
5. 沿着绘制的轮廓切割，直，洗净切块，以确保进入通道没有粘合剂突出。
6. 清洁的石英彻底使用丙酮或乙醇删除从以前的流通池建设的粘合剂。
7. 找到最佳通道纲要对齐，删除背胶的一面，并小心地将磁带上的石英片。要小心，以正确对齐磁带，入口和出口孔要保持畅通。
8. 削减的进风口和流动池出口的管道长度。它有助于减少约30 °角管，使管会不按对腔底部的平面。放置在某种支持暂停不易附着在接下来的步骤流细胞管。
9. 链霉菌涂层的盖玻片，用水彻底冲洗和干燥的压缩空气。请记住，只有一面是官能;要小心不要把盖玻片。取出磁带备份的另一边，并将其放置到盖玻片的石英片。
10. 盖玻片上轻按推被困在胶粘剂任何空气。这将有助于避免气泡进入流道。
11. 用环氧树脂密封室的两侧。插入石英和地方用环氧树脂密封的孔切管。这需要几分钟干。
12. 干燥后，开始阻止通过一个管子拉一些脱气封闭液的表面。非常适合一个21号的针管内0.76毫米。冲洗几次，以去除气泡，并允许至少一个半小时的孵化室。

4。单分子复制实验

材料：编写流室，SYTOX橙，TIRF显微镜，532 nm激光，CCD摄像头，图像采集软件的计算机，滚环DNA底物，复制蛋白

1. 流动池已被封锁后，一切准备就绪后开始的单分子实验。
2. 以流动细胞和它放在显微镜舞台上。保持阶段剪辑室的地方，并确保流道直沿Y轴定位。
3. 将流动池出口管注射泵使用较大直径的连接管或针。入口放置在封闭液和注射器，在管中删除任何空气，回拉。一个出水口管轻轻一抖，将帮助被困在流动池清除任何空气气泡。
4. 25日下午在1毫升封闭液稀释股DNA为模板。在中等流量室的DNA，让良好的表面覆盖的流入。 0.025毫升/分钟的30分钟，效果很好。基于多少DNA分子表面上每一批盖玻片，或有多少人所需的实验，这可以是多种多样的。
5. 一旦DNA中，洗出多余的DNA，用封闭液。至少有200卷流细胞洗涤除去所有的游离DNA。
6. 开始脱气复制缓冲区。对于的大肠杆菌大肠杆菌的复制实验，在37 ° C，以减少在激烈的流动腔泡沫的风险。
7. 打开激光和摄像机。冷却CCD需要达到的温度才可以使用。
8. 如果执行37 ° C实验，打开加热器。要确定的目标是在与流通池接触，否则将散热片后。
9. 洗衣机和脱气后的反应可以有所准备。混合核苷酸，数码地面电视服务，并在复制缓冲区SYTOX。然后添加蛋白质，轻轻混匀。
10. 反应混合物流入流通池。这种流动的速度，需要足够的伸展双链。对于一个宽2毫米，高100微米流道0.04 mL / min的作品。
11. 允许混合物进入会议厅，并开始成像的时候。一个好的技巧是将视野通道一侧，并专注于不干胶材料。这将确保你聚焦表面附近。
12. 调整激光功率，显微镜的重点和TIRF角度。保持低功耗，以避免任何染色的DNA photocleavage。几分钟取决于DNA的复制率在1-5帧/秒的收购。如果需要，重复，以获得更长的的复制轨迹或移动到一个新的领域看到更多的分子。
13. 反应后的混合物几乎是空白，它是一个好主意，流更多的缓冲区YTOX看到其他领域的观点。以多个不同的复制分子形象提供processivity决心的统计资料。

5。代表性的成果

积极复制分子很容易被视为增长染色DNA。在我们的实验中，流淌的M13基板时25给出了一个60X，125微米× 125的观点微米领域（图1）100-1000分子。执行复制实验中使用的大肠杆菌大肠杆菌复制体蛋白在37 ° C（详情请参阅材料），每5-50复制分子的视野。当量浓度的T7复制体，在基板上更有效地启动，我们观察到在一个领域复制分子的70％。这些条件会产生一个产品的密度如此之高，单个分子难以解决和分析，这样的T7的实验是在较低的蛋白浓度进行。

数据分析：要获得率数据，只需情节的DNA与时间的终点，并计算斜率（图2 ）。 processivity，确定总长度的DNA。这些数字都将需要转换为碱基对。在进行实验之前，你应该知道在适当的放大倍率的相机的像素大小。碱基的转换，简直是一个很好的估计基础上的DNA晶体的长度，2.9 BP /纳米转换。但是，层流不会完全伸展的DNA，因此应当由执行到一个已知长度的DNA，如48502 BPλDNA，用生物素标记的寡核苷酸，它附着到流通池和测量SYTOX染色长度的DNA长度校准复制实验所用的流量。确定的碱基对/像素数量将允许精确计算的复制率和processivities。以大量的图片和电影，将提供大量的产品分子，使密谋率和processivity分布（图^2） 1。

图1：（从编号1）。）卡通的滚环复制检测。 （SA，链）。领先的链合成的延伸的尾部连接圈和表面。尾巴转换为双链DNA的滞后链聚合酶和层流捉襟见肘。
B）SYTOX Orange和532 nm激发的范例领域。小荧光点的系绳，非复制的基板。请注意产品的极端的长度和每场的产品（每个流动池包含5000等领域）的大量。

图2：（改编自文献1）。A，B）典型的复制分子Kymographs T7（A） 和 E 大肠杆菌 （二）实验。 C）a）和b）的分子端点轨迹绘制随时间变化。轨迹都配有线性回归获得复制率。所示的例子是99.4 BP ^s - 1和467.1 BP ^s - 1时。 D）复制产品的长度分布，配合单指数衰减，获得processivity：25.3 ± 1.7 KBP（T7），85.3 ± 6.1 KBP（大肠杆菌）。 E）的单分子轨道的速率分布，配合单高斯。方式：75.9 ± 4.8 BP ^s - 1时（T7），535.5 ± 39 BP ^s - 1时（ 大肠杆菌 ）。

Discussion

一个关键控制研究的污点，SYTOX橙的效果，感兴趣的复制蛋白。一个简单的方法做，这是执行中所述的流通池，但SYTOX遗漏的复制实验。反应混合物通过室流出后，添加SYTOX缓冲区，染色的DNA，并检查复制的分子长度分布。另外，标准的散装反应，可以用来检查任何SYTOX复制速度和效率的影响。

这里所描述的实验中只使用一个单一的流道。这是可以改变的，很容易通过建立多渠道的流量商会或采用硅橡胶或类似的微流体装置。增加频道数量，大大有利于蛋白质的浓度，突变体，或抑制剂分子的筛选和增加了复制数据收集的速度。

如上所述，我们执行的E.大肠杆菌复制实验在37 ° C使用一个自制的铝流细胞加热器，电阻加热元件（墨盒热水器）和可变电源。这使良好的温度稳定性和避免购买一个客观的加热器。要校准加热器，我们只需在石英流通池的顶部中心钻了一个洞，流道插入热电偶和流动是正常的缓冲区。在增加电压的流通池缓冲区的温度测量，可以实现精确的加热。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M13mp18 ssDNA	New England Biolabs	N4040
Biotinylated Tail Oligo	Integrated DNA Technologies
T7 DNA Polymerase	New England Biolabs	M0274	Use T7 replication buffer for substrate preparation
Phenol/ Isoamyl Alcohol/ Chloroform	Roche Group	03117987001	24:24:1 v/v
3-aminopropyl-triethoxysilane	Sigma-Aldrich	A3648	Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG	Nektar		Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS	Nektar
Double-sided tape	Grace Bio-Lab Inc.	SA-S-1L	100 μm thickness
Quartz slide	Technical Glass	20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)	Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing	BD Biosciences	427416	0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted.
Streptavidin	Sigma-Aldrich	S4762	Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix	New England Biolabs	N0447
Ribonucleotide triphosphate solutions	Amersham	272056 272066 272076 272086
SYTOX Orange	Invitrogen	S11368	Other dsDNA stain can be used
Fluorescence Microscope with 60x TIRF objective	Olympus Corporation	IX-71	Microscope, camera, etc. can be substituted for similar equipment
Syringe Pump	Harvard Apparatus	11 Plus	Operate in refill mode to facilitate solution changes
532 nm laser	Coherent Inc.	Compass 215M-75	Select wavelength to correspond to stain of choice
EMCCD Camera	Hamamatsu Corp.	ImagEM
Emission filter	Chroma Technology Corp.	HQ600/75m
T7 Replication: 40 mM Tris pH 7.5, 50 mM potassium glutamate, 10 mM magnesium chloride, 100 μg/mL BSA, with 5 mM dithiothreitol, 600 μM dNTPs, 300 μM ATP, 300 μM CTP, and 15 nM SYTOX Orange added immediately before use. Proteins added as: 5 nM gp4 (hexamer), 40 nM polymerase (1:1 gp5: thioredoxin), 360 nm gp2.51,5. E. coli Replication: 50 mM HEPES pH 7.9, 12 mM magnesium acetate, 80 mM potassium chloride, 100 μg/mL BSA with 10 mM dithiothreitol, 40 μM dNTPs, 200 μM rNTPs, and 15 nM SYTOX Orange added immediately before use. Proteins added as: 30 nM DnaB (hexamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM αεθ, 15 nM τ2γ1δδ’χψ or τ3δδ’χψ, 30 nM β (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 nM PriB, 320 nM PriC, 480 nM DnaT1,6
E. coli Replication: 50 mM HEPES pH 7.9, 12 mM magnesium acetate, 80 mM potassium chloride, 100 μg/mL BSA with 10 mM dithiothreitol, 40 μM dNTPs, 200 μM rNTPs, and 15 nM SYTOX Orange added immediately before use. Proteins added as: 30 nM DnaB (hexamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM αεθ, 15 nM τ2γ1δδ’χψ or τ3δδ’χψ, 30 nM β (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 nM PriB, 320 nM PriC, 480 nM DnaT1,6