Visualisera enda molekyl DNA-replikering med fluorescensmikroskopi

Summary

Detta protokoll visar en enkel enda molekyl teknik fluorescensmikroskopi för att visualisera DNA-replikation av enskilda replisomes i realtid.

Abstract

Vi beskriver en enkel fluorescensmikroskopi-baserat realtids-metod för att observation DNA-replikation vid enda molekyl nivå. En cirkulär, kluvna DNA-mall är kopplad till en functionalized glas täckglas och kopieras i stor utsträckning efter införandet av replikering proteiner och nukleotider (figur 1). Den växande produkt som dubbel-DNA (dsDNA) utökas med laminärt flöde och visualiseras med hjälp av en intercalating färgämne. Mätning av positionen av den växande DNA-mål i realtid ger en exakt bestämning av replikering ränta (figur 2). Vidare rapporter längden färdig DNA-produkter på processivity av replikering. Detta experiment kan utföras mycket snabbt och enkelt och kräver bara en fluorescensmikroskop med en någorlunda känslig kamera.

Protocol

Innan du utför en enda molekyl replikering experiment, ett par material som behöver förberedas i förväg.

1. DNA-replikering Mall

Underlaget för replikering reaktionen är en biotinylerad, tailed M13 rullande cirkel beredd med hjälp av vanliga molekylärbiologiska tekniker ^1,2.

Material: M13mp18 enda DNA, biotinylerad svans oligonukleotid primer (5'-Biotin-T ₃₆ AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3), T7 DNA-polymeras, värmeblock, Fenol / Isoamyl Alkohol / Kloroform

1. Glödga den biotinylerad svansen oligo till M13 genom att lägga till en 10-faldigt högre än oligo i TBS-buffert (330 nM svans oligo, 33 nM M13).
2. Värm blandningen till 65 ° C i värmen blocket. När uppvärmd, stäng av värmen blockera och tillåta långsam nedkylning ordentligt glödga grundfärgen.
3. Lägg till primas M13 till en blandning av 64 nM T7 DNA-polymeras och T7 replikering buffert innehållande dNTPs och MgCl _2.
4. Inkubera reaktionen vid 37 ° C i 12 minuter och släcka med 100 mM EDTA.
5. Rena ifyllda produkt DNA med fenol / kloroform / Isoamyl alkohol utvinning och dialyze till TE buffert eller annan lämplig förvaring buffert och bestämma DNA-koncentration (Back-extrakt varje organiska fasen att återhämta eventuella kvarstående primas M13).
6. En iteration av mall preparatet kan enkelt göra flera milliliter nanomolära koncentration mall, tillräckligt för hundratals till tusentals enda molekyl experiment.

2. Functionalized Täckglas

För att fästa DNA på glaset täckglas är glaset first functionalized med en aminosilane som sedan kopplas till biotinylerad PEG molekyler. Denna beläggning bidrar till att minska ospecifik interaktion mellan DNA och proteiner replikering med ytan ^1,3.

Material: Glas täckglas, färgning burkar, 3-aminopropyltriethoxysilane, Methoxy-PEG5k-NHS-ester, Biotin-PEG5k-NHSester, aceton, 1M KOH, Etanol, Ugn, Badkar sonicator

1. Rengör glaset täckglasen genom att placera dem i färgning burkar och fylla burkarna med etanol. Sonikera i 30 minuter och skölj ur burkar och fyll med 1 M KOH. Sonikera i 30 minuter Upprepa både tvättar.
2. För första funktionalisering reaktion, alla spår av vatten måste tas bort. Fyll burkarna med aceton och låt ligga i 10 min. Skölj burkarna igen med aceton.
3. Bered en 2% v / v lösning av silan reagens i aceton. Lägg till färgningen burkar och skaka i 2 minuter. Denna reaktion par i alkoxi grupp av aminosilane mot glaset, vilket ger en reaktiv amin för nästa koppling steg. Släck reaktionen med ett stort överskott av vatten.
4. Torka täckglasen genom att baka dem i 110 ° C i ugnen i 30 minuter.
5. Förbered en 50:1 metoxi: biotin PEG blandning i 100 mm NaHCO ₃ pH 8,2. Sikta på ca 0,2% w / v biotinylerad PEG.
6. Pipettera 100 mikroliter av PEG blandningen på en torr silaniseras täckglas och placera en annan täckglas ovanpå. Inklusive en spacer glas täckglas tillåter separation av täckglas.
7. Inkubera täckglasen i PEG-lösning i 3 timmar, därefter separera varje par av täckglas och tvätta mycket med vatten. Var noga med att hålla täckglasen functionalized uppåt eftersom endast en gång sida kommer att vara belagda med PEG.
8. Torka täckglas och förvara under vakuum. Ytorna är hållbar i minst en månad, så massor av täckglas kan göras i ett parti och används efter behov.

Dessa material bör göras i förväg, och sedan användas för varje experiment. För att starta varenda molekyl experiment, börja med att samla flödet kammaren.

3. Flöde avdelningen Förberedelser

Experimentet utförs med hjälp av ett enkelt flöde kammare konstruerad med en functionalized täckglas, dubbelhäftande tejp, en kvarts bild och slang. Ett flöde kammare är förberedd för varje enskild molekyl experiment ^1,4.

Material: Dubbelhäftande tejp, rakblad, Quartz bild med hål för slang, snabbtorkande epoxy, functionalized täckglas (se ovan), Streptavidin lösning (25 mikroliter av 1 mg / ml i PBS), Slangar, blockerande buffert (20 mM Tris pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,2 mg / mL BSA, 0,005% Tween-20)

1. Börja med att placera 20-25 ml blockerande buffert i en exsickator för att ta bort eventuella luftbubblor för senare steg.
2. Ta en PEG-functionalized täckglas och spridningen 125 PBS-utspädd streptavidin lösning över ytan. Lämna detta till inkubera i 20 minuter medan du förbereder övriga delar av kammaren, så streptavidin att binda ytan biotins.
3. Klipp en bit dubbel sidad tejp för att matcha storleken på kvarts bilden. Markera positionen för slangen hålen på bandet med en penna så att en översikt av flödet kammaren kan ritas på bandet (1 mg / ml).
4. Gör en 2 mm bred rektangel runt hålen. Detta kommer att fungera som flödet kanal, så se till att göra raka sidor och lämna utrymme runt röret in-och utlopp. Om så önskas kan flera kanaler eller olika storlekar användas.
5. Klipp längs den ritade konturen och gör raka, rena snitt så att ingen självhäftande sticker in i kanalen.
6. Rengör kvarts noggrant med aceton eller etanol för att ta bort lim från föregående flödescell konstruktion.
7. Hitta de bästa anpassningen av kanalen kontur, ta bort ena sidan av självhäftande baksida och försiktigt placera tejpen på kvarts bilden. Var noga med att anpassa bandet ordentligt, som in-och utlopp hål måste förbli hävs.
8. Klipp längder av rör för inlopp och utlopp av flödet cellen. Det bidrar till att minska i slutet av röret på ca en 30 graders vinkel så att slangen inte kommer att trycka platt mot kammaren botten. Placera rören på någon form av stöd för att skjuta dem för enkel infästning i flödescellen i nästa steg.
9. Skölj streptavidin-belagda täckglas ordentligt med vatten och torka med tryckluft. Kom ihåg att endast en sida är functionalized, vara noga med att inte sätta på täckglaset över. Ta bort den andra sidan av bandet bakom och placera kvarts bilden på täckglas.
10. Tryck lätt på täckglas att pressa ut all luft i limmet. Detta kommer att bidra till att undvika eventuella luftbubblor kommer in i flödet kanal.
11. Täta sidor av kammaren med epoxi. Sätt skär slangen i hålen av kvarts och tätningen på plats med epoxi. Detta måste torka i ett par minuter.
12. När torr, börjar blockera ytan genom att dra några av de avgasade blockerande buffert genom ett rör. En 21-gauge nål passar perfekt in i 0,76 mm slang. Spola några gånger att ta bort luftbubblor och låta kammaren till inkubera i minst en halvtimme.

4. Enda molekyl replikering Experiment

Material: Förberedd flöde kammare, SYTOX Orange, TIRF mikroskop, 532 nm laser, CCD-kamera, dator med bild förvärv programvara, rullande cirkel DNA-substrat, replikering proteiner

1. Efter flödescellen har blockerats, allt är redo att börja den enda molekyl experiment.
2. Ta flödet cellen och placera den på mikroskop scenen. Håll kammaren på plats med scenen klipp och se till att flödet kanalen är placerad rakt längs y-axeln.
3. Anslut flödet röret cellen utlopp till sprutan pumpen med en större slang diameter kontakten eller en nål. Placera inloppet i blockerande buffert och dra tillbaka sprutan för att avlägsna eventuell luft i röret. Ett lätt snärt med utloppsrör kommer att klara eventuella luftbubblor fastnar i flödet cellen.
4. Späd mallen lager DNA till 25 PM i 1 ml blockerande buffert. Strömma in i kammaren i måttlig flödeshastighet så att en god yttäckning av DNA. 0,025 ml / min i 30 minuter fungerar bra. Detta kan varieras beroende på hur många DNA-molekyler på ytan för varje parti täckglas eller hur många önskas för experimentet.
5. När DNA är i, tvätta bort överflödigt DNA med blockerande buffert. Tvätta för minst 200 flöde-cell volymer att bli av med alla gratis DNA.
6. Börja avgasning replikeringen buffert. För E. coli replikering experiment, göra detta vid 37 ° C för att minska risken för bubblor i den uppvärmda flödet kammaren.
7. Sätt på lasern och kameran. Den kylda CCD måste nå temperatur innan den kan användas.
8. Om du utför en 37 ° C experiment, slå på värmaren. Se till att målet är i kontakt med flödet cellen eller det kommer att bli en kylfläns senare.
9. Efter tvättning och tankrengöring, kan reaktionen vara beredd. Blanda nukleotider, DTT och SYTOX i replikering buffert. Tillsätt sedan proteiner och blanda försiktigt.
10. Flow reaktionsblandningen i flödet cellen. Detta flödeshastighet måste vara tillräcklig för att sträcka dsDNA. För en 2-mm bred, 100-ìm högt flöde kanal 0,04 ml / min fungerar bra.
11. Tillåt tid för blandningen att komma in i kammaren och börja avbildning. Ett bra tips är att flytta synfältet åt sidan av kanalen och fokusera på självhäftande material. Detta kommer att säkerställa att du är nära ytan för fokusering.
12. Justera lasereffekt, mikroskop fokus och TIRF vinkel. Behåll makten låg för att undvika photocleavage av de färgade DNA. Förvärva 1-5 bilder / sekund i flera minuter, beroende på graden av DNA-replikation. Om så önskas, upprepa för att få längre replikering banor eller flytta till ett nytt fält för att se fler molekyler.
13. När reaktionsblandningen är nästan tom, är det en bra idé att flyta i mer buffert med SYTOX att se andra synfält. Att ta flera bilder av olika replikerade molekyler innehåller statistik för processivity beslutsamhet.

5. Representativa resultat

Aktivt replikerar molekyler ses gärna som växer rader av färgade DNA. I våra experiment, flödande 25 pM av M13 substratet ger 1-100 molekyler i en 60x, 125 ìm x 125 ìm synfältet (Figur 1). Utföra replikering experiment med E. coli replisome proteiner vid 37 ° C (se Material för detaljer) ger 5-50 replikerar molekyler per synfält. På motsvarande koncentrationer av T7 replisome, som initierar på underlaget mycket effektivare, observerar vi> 70% av molekylerna i ett fält replikera. Dessa villkor ger en produkt täthet så hög att enskilda molekyler är svåra att lösa och analysera, så T7 experiment utförts med lägre protein koncentrationer.

Dataanalys: För att få månadsavgift, bara tomt ändpunkten av DNA-tid och beräkna lutningen (figur 2). För processivity, fastställa den totala längden av DNA. Båda dessa siffror kommer att behöva konverteras till baspar. Innan du utför experimentet bör du känna till pixelstorlek på kameran vid rätt förstoring. För basepair konvertering, är en bra uppskattning konvertera helt enkelt baseras på de kristallografiska längden av DNA, 2,9 bp / nm. Dock kommer laminärt flöde inte helt sträcka DNA, så en DNA-längd kalibrering bör utföras genom att ta en känd längd DNA, t.ex. 48.502 bp λ DNA kopplar den till flödet cell med en biotinylerad oligo och mäta SYTOX-färgade längd vid flödet används för replikering experiment. Bestämmande av antalet baspar / pixel låter exakt beräkning av replikering priser och processivities. Ta många bilder och filmer kommer att erbjuda ett stort antal produkter molekyl, så plottning av hastighet och processivity distributioner (figur 2) ^1.

Figur 1: (Från Ref 1.) A) tecknad av den rullande-cirkel replikering analys. (SA, streptavidin). Ledande-strand syntes förlänger svansen knyta cirkeln och yta. Svansen omvandlas till dsDNA som släpar del polymeras och sträckte med laminärt flöde.
b) Exempel synfält med SYTOX Orange och 532 nm excitation. Små fluorescerande fläckar är bundna, icke-replikerade substrat. Notera den extrema längden på produkterna och det stora antalet produkter per fält (varje flöde cell innehåller> 5000 sådana fält).

Figur 2: (anpassad från Ref 1.) A, b) Kymographs typiska replikerar molekyler från T7 (a) och E. coli (b) experiment. c) Endpoint banor av molekyler från a) och b) plottas mot tiden. Banor är försedda med linjär regression för att erhålla replikering priser. Visas exempel är 99,4 bp s ^-1 och 467,1 bp s ^-1. d) Längd distributioner av replikering produkter passar med enkel exponentiell förruttnelse att få processivity: 25,3 ± 1,7 KBP (T7), 85,3 ± 6,1 KBP (E. coli). e) Rate distributioner av enda molekyl banor, passar med enkel Gaussians. Medel: 75,9 ± 4,8 bp s ^-1 (T7), 535,5 ± 39 räntepunkter s ^-1 (E. coli).

Discussion

En kritisk kontroll är att undersöka effekten av fläcken, SYTOX Orange, på efterbildningen proteiner av intresse. Ett enkelt sätt att göra detta är att utföra replikering experiment i flödet cellen som beskrivs, men med utelämnande av SYTOX. När reaktionsblandningen har strömmat genom kammaren, lägga buffert med SYTOX att färga DNA och undersöka längdfördelning replikerade molekyler. Alternativt kan standard bulk reaktioner användas för att kontrollera någon effekt av SYTOX på replikering hastighet och effektivitet.

Experimentet som beskrivs här används bara en enda flöde kanal. Detta kan ändras enkelt genom att skapa flerkanaligt kammare flöde eller med hjälp av PDMS eller liknande mikroflödessystem enheter. Att öka antalet kanaler som avsevärt underlättar screening av protein koncentrationer, mutanter, eller molekyler hämmare och ökar snabbheten i replikering datainsamling.

Som nämnts genomför vi E. coli replikering experiment vid 37 ° C med hjälp av en hemmabyggd aluminium värmare flödescellen, ett resistivt värmeelement (patron värmare) och rörlig strömförsörjning. Detta ger en god temperaturstabilitet och undviker att köpa ett objektiv värmare. För att kalibrera värmare, borrade vi helt enkelt ett hål i mitten av en kvarts flödescell topp, infogas ett termoelement i flödet kanal och flöt buffert som vanligt. Mätning av framledningstemperaturen cellen buffert till att öka spänningar ger möjlighet till exakt uppvärmning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M13mp18 ssDNA	New England Biolabs	N4040
Biotinylated Tail Oligo	Integrated DNA Technologies
T7 DNA Polymerase	New England Biolabs	M0274	Use T7 replication buffer for substrate preparation
Phenol/ Isoamyl Alcohol/ Chloroform	Roche Group	03117987001	24:24:1 v/v
3-aminopropyl-triethoxysilane	Sigma-Aldrich	A3648	Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG	Nektar		Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS	Nektar
Double-sided tape	Grace Bio-Lab Inc.	SA-S-1L	100 μm thickness
Quartz slide	Technical Glass	20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)	Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing	BD Biosciences	427416	0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted.
Streptavidin	Sigma-Aldrich	S4762	Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix	New England Biolabs	N0447
Ribonucleotide triphosphate solutions	Amersham	272056 272066 272076 272086
SYTOX Orange	Invitrogen	S11368	Other dsDNA stain can be used
Fluorescence Microscope with 60x TIRF objective	Olympus Corporation	IX-71	Microscope, camera, etc. can be substituted for similar equipment
Syringe Pump	Harvard Apparatus	11 Plus	Operate in refill mode to facilitate solution changes
532 nm laser	Coherent Inc.	Compass 215M-75	Select wavelength to correspond to stain of choice
EMCCD Camera	Hamamatsu Corp.	ImagEM
Emission filter	Chroma Technology Corp.	HQ600/75m
T7 Replication: 40 mM Tris pH 7.5, 50 mM potassium glutamate, 10 mM magnesium chloride, 100 μg/mL BSA, with 5 mM dithiothreitol, 600 μM dNTPs, 300 μM ATP, 300 μM CTP, and 15 nM SYTOX Orange added immediately before use. Proteins added as: 5 nM gp4 (hexamer), 40 nM polymerase (1:1 gp5: thioredoxin), 360 nm gp2.51,5. E. coli Replication: 50 mM HEPES pH 7.9, 12 mM magnesium acetate, 80 mM potassium chloride, 100 μg/mL BSA with 10 mM dithiothreitol, 40 μM dNTPs, 200 μM rNTPs, and 15 nM SYTOX Orange added immediately before use. Proteins added as: 30 nM DnaB (hexamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM αεθ, 15 nM τ2γ1δδ’χψ or τ3δδ’χψ, 30 nM β (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 nM PriB, 320 nM PriC, 480 nM DnaT1,6
E. coli Replication: 50 mM HEPES pH 7.9, 12 mM magnesium acetate, 80 mM potassium chloride, 100 μg/mL BSA with 10 mM dithiothreitol, 40 μM dNTPs, 200 μM rNTPs, and 15 nM SYTOX Orange added immediately before use. Proteins added as: 30 nM DnaB (hexamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM αεθ, 15 nM τ2γ1δδ’χψ or τ3δδ’χψ, 30 nM β (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 nM PriB, 320 nM PriC, 480 nM DnaT1,6