Summary
Nós demonstramos o protocolo para a geração de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de células somáticas humanas usando lentivírus mediada entrega dos fatores humanos Oct4, Sox2, Nanog e Lin28. Pluripotência foi confirmado pela morfologia e pela presença de tronco embrionárias (ES) de células específicas marcadores.
Abstract
Em 2006, Yamanaka e seus colegas demonstraram que primeiro retrovírus mediada entrega e expressão de Oct4, Sox2, c-Myc e KLF4 é capaz de induzir o estado pluripotente em fibroblastos do ratinho. 1 O mesmo grupo também relatou a reprogramação de células somáticas humanas em pluripotentes induzidas da haste (iPS) células usando versões humanas dos fatores de transcrição mesma entregue por vetores retrovirais. 2 Além disso, James Thomson et al. relataram que os lentivírus mediada por co-expressão de um outro conjunto de fatores (Oct4, Sox2, Nanog e Lin28 ) foi capaz de reprogramar as células somáticas humanas em células iPS. 3
As células iPS são similares às células-tronco embrionárias na proliferação, morfologia e a capacidade de se diferenciar em todos os tipos de tecido do corpo. As células iPS humanas têm uma vantagem distinta sobre células-tronco embrionárias como eles apresentam propriedades-chave das células-tronco embrionárias sem o dilema ético de destruição de embriões. A geração de células específicas do paciente iPS contorna um obstáculo importante para terapias personalizadas medicina regenerativa, eliminando a possibilidade de rejeição imunológica de não-autólogo de células transplantadas.
Aqui demonstramos o protocolo para a reprogramação de células de fibroblastos humanos usando o Set Lentivirus Stemgent Humanos TF. Também mostramos que as células reprogramadas com este conjunto começar a mostrar iPS morfologia quatro dias pós-transdução. Usando o Y27632 Stemolecule, foram selecionadas para as células iPS e morfologia correta observada após três rodadas seqüenciais de colônia de colheita e passaging. Também demonstram que, após a reprogramação de células exibido a pluripotência marcador AP, marcadores de superfície TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, e SSEA-3, e marcadores nuclear Oct4, Sox2 e Nanog.
Protocol
1. Reprogramação
- Semente de células BJ a uma densidade de 1 x 10 5 células por poço de uma placa de seis poços. Cultura das células em 2 ml de meio de crescimento (450 ml EMEM suplementado com 50 ml ES FBS qualificado, 5 ml 10 mM não-aminoácidos essenciais, 5 ml de penicilina / estreptomicina, 5 ml 200 mM L-glutamina e 0,9 ml β 55 mm -mercaptoetanol) durante a noite a 37 ° C e 5% CO 2.
- No mesmo dia, começar a preparar pratos de alimentação MEF pela adição de 0,1% de gelatina diluído em água a uma placa de 6 bem e incubar overnight a 37 ° CO C e 5% 2.
- Após a incubação, remova o meio das células BJ e adicionar 2 ml meio de crescimento suplementado com 6 mg / ml de polibrene, 500 mL hOct4-lentivírus, 50 ul hSox2-lentivírus, 50 ul hNanog lentivírus e 50 ul hLin28 lentivírus-a cada poço . Agite levemente o prato para garantir um revestimento uniforme do médium. Incubar overnight a 37 ° CO C e 5% 2.
- No mesmo dia, retire 1 frasco de células CF-1 MEF de nitrogênio líquido e descongelamento. Remover o líquido dos poços revestidos de gelatina (ver passo 1.2) e adicionar células alimentadoras MEF com uma densidade de 0,2 x 10 5 células / poço. O volume total por poço deve ser de 2ml de células no MEF meio de crescimento (450 ml DMEM suplementado com 50 ml e 5 ml FBS não-aminoácidos essenciais).
- No dia seguinte, retire as células BJ com 0,05% de tripsina / EDTA e centrifugar a 200 xg por 5 minutos. Aspirar a médio e ressuspender em meio de crescimento. Remova o meio do prato alimentador MEF (ver passo 1.4) e adicionar 2 ml / poço da suspensão de células BJ. A concentração de células deve ser de aproximadamente 5 x 10 4 células / poço. Incubar overnight a 37 ° CO C e 5% 2.
- Substituir média 24 horas após a re-semeadura com meio de cultura humana ES / iPS de células (400 ml DMEM/F12 suplementada com 100 ml de soro substituição Knockout, 5 ml 10 mM não-aminoácidos essenciais, 5 ml 200 mM L-glutamina, 0,9 ml 55 mM β-mercaptoetanol e 20 ng / ml bFGF humana recombinante). Mudança média a cada 24 horas durante 7 dias.
- Após sete dias, a mudança de médio a MEF meio condicionado (ver secção 2).
2. Preparação do MEF meio condicionado
- Semente CF-1 células MEF alimentador de 2 x 10 5 células / poço em uma placa de 6 bem no meio de crescimento 2 ml MEF. Incubar overnight a 37 ° CO C e 5% 2.
- Alterar médio e meio de cultura humana ES / iPS de células. Incubar overnight a 37 ° CO C e 5% 2.
- Recolher o sobrenadante a cada 24 horas durante quatro dias. Filtrar o sobrenadante através de um filtro mM 0,22.
- Suplemento sobrenadante com 50 ng / ml de bFGF.
3. iPS Seleção Colony e Passaging
- Selecione uma colônia ES-like e re-semente em meio de cultura humana ES / iPS suplementado com 10 mM de Stemolecule Y27632 em pratos de cultura de células pré-semeado com FC-1 células alimentadoras MEF. Incubar overnight a 37 ° CO C e 5% 2.
- Mudar o meio de cultura a cada 24 horas durante os primeiros sete dias (sem a suplementação com Stemolecule Y27632). Após sete dias, a mudança de médio a MEF meio condicionado (ver secção 2 para a preparação). Continuamos passaging as células até que eles apresentaram morfologia ES humano típico.
4. Exame imunocitoquímico de marcadores pluripotência
- Lave suavemente as células três vezes com PBS.
- Fixar as células com 500 mL de fixador por 20 minutos em temperatura ambiente.
- Lave suavemente as células três vezes com PBS.
- Bloco de ligação não específica com 500 mL de buffer de bloqueio para uma hora em temperatura ambiente.
- Incubar as células com 250 mL do anticorpo primário específico durante a noite a 4 ° C (usamos TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4, Sox2, Nanog e Lin28 a 1:100 diluições).
- Lave suavemente as células três vezes com PBS.
- Incubar as células com 250 mL de anticorpo secundário por 1 hora à temperatura ambiente, mantendo-se longe da luz (usamos cabra anti-camundongo conjugado IgM Cy3, cabra anti-camundongo conjugado IgG Cy3, cabra anti-IgM Rat Cy3 conjugado e de cabra anti- coelho conjugado Cy3 em diluições 1:300).
- Lave suavemente as células três vezes com PBS.
- Adicionar DAPI (concentração final de 1 mg / ml) para a última lavagem e incubar 5 minutos para visualizar núcleos.
- Analisar as células sob a ampliação.
Parte 5: Resultados Representante
1. Resultados morfologia:
Fibroblastos humanos prepúcio (BJ), as células foram co-transduzidas com Oct4, Sox2, Nanog e Lin28. Alterações morfológicas foram observadas logo dia 4 pós-transdução, eo aglomerado de células se tornou mais denso no dia 17 (Figura 1). Colônias foram manualmente colhidas no dia 25 e cultivadas em FC-1 células alimentadoras MEF. Para facilitar a formação de colônias de células iPS após a reprogramação, usamos Stemolecule Y27632, Um inibidor ROCK, para o plantio inicial de noite durante cada passagem. colônias de células iPS com boa morfologia foram observadas após três rodadas seqüenciais de colônia de colheita e passaging.
2. Expressão de marcadores pluripotência:
De melhor caracterizar as colônias isoladas das células iPS, nós olhamos para a presença de marcadores de pluripotência comuns expressos em células ES. As colônias exibiram forte atividade de fosfatase alcalina (AP) (Figura 2). Além disso, imunocitoquímica (ICC) foi realizado nas colônias de células iPS com um painel de anticorpos marcador específico pluripotência, incluindo marcadores de superfície TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 e SSEA-3, bem como marcadores nuclear Oct4, Sox2 e Nanog. As colônias isoladas iPS foram positivos para todos os marcadores (Figura 3). Os resultados mostram que o ICC células iPS exibiram o padrão de expressão apropriada pluripotência marcador, demonstrando que essas células iPS se assemelham células indiferenciadas embrionárias humanas.
Figura 1: As alterações morfológicas de células transduzidas BJ. Imagens de campo claro de uma colônia típica de células iPS formado em (A) 4 dias e (B) 17 dias após a transdução.
Figura 2: AP atividade de células reprogramadas BJ. Três colônias diferentes corados com Kit de coloração Fosfatase Alcalina Stemgent.
Figura 3: As células humanas iPS expressam altos níveis dos marcadores celulares específicos ES seguintes: marcadores de superfície TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 e SSEA-3, e marcadores nucleares 04 de outubro, Nanog e Sox2.
Discussion
Estes resultados demonstram que o conjunto de Lentivirus Stemgent Humanos TF pode ser usado para gerar de forma eficiente colônias iPS, induzindo a expressão ectópica de transduzidas fatores de transcrição em fibroblastos humanos. Ao projetar experimentos reprogramação, diversas variáveis devem ser considerados para otimizar a eficiência de reprogramação. Primeiro, a relação vírus-a-alvo ativa (multiplicidade de infecção MOI) pode precisar ser modificado durante a etapa de transdução primária para alcançar a eficiência de transdução ideal. Em segundo lugar, a condição de crescimento das células-alvo pode ter impacto reprogramação. Células saudáveis e proliferativa são mais suscetíveis de reprogramação. Terceiro, ao modificar o protocolo de número de células diferentes, recomenda-se que o número de células-alvo ser ajustado proporcionalmente à área da superfície da placa de cultura. Por último, os inibidores da ROCHA aplicação, tais como Y27632 devem ser considerados para ajudar a garantir a reprogramação de sucesso como estudos recentes têm demonstrado a sua utilidade na sobrevivência melhorar colônia TEh 4,5.
Disclosures
Os autores deste artigo são empregados por Stemgent que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human TF Lentivirus Set | Stemgent | 00-0005 | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| TRA-1-81 antibody | Stemgent | 09-0012 | |
| TRA-1-60 antibody | Stemgent | 09-0009 | |
| SSEA-4 antibody | Stemgent | 09-0003 | |
| SSEA-3 antibody | Stemgent | 09-0014 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thompson, J. A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (1917).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Koyanagi, M., Takahashi, J., Arakawa, Y., Doi, D., Fukuda, H., Hayashi, H., Narumiya, S., Hashimoto, N. Inhibition of the Rho/ROCK pathway reduces apoptosis during transplantation of embryonic stem cell-derived neural precursors. J. Neurosci. Res. 86, 270-280 (2008).
