Summary
मिट्टी माइक्रोबियल समुदाय से उच्च आणविक भार और उच्च गुणवत्ता जीनोमिक डीएनए अलग पद्धति में वर्णित है.
Abstract
मिट्टी microbiome जीनोमिक विविधता और चयापचय नवीनता है कि परिचित पोषक तत्व और स्थलीय पारितंत्रों के भीतर ऊर्जा का प्रवाह के साथ जुड़ा हुआ है की एक विशाल और अपेक्षाकृत बेरोज़गार जलाशय है. खेती स्वतंत्र पर्यावरण जीनोमिक metagenomic रूप में भी जाना जाता है, दृष्टिकोण मार्ग और उच्च मूल्य चिकित्सीय और बायोमास रूपांतरण की प्रक्रिया के लिए कार्यात्मक स्क्रीनिंग पुनर्निर्माण करने के लिए सम्मान के साथ इस आनुवंशिक जानकारी के लिए अभूतपूर्व पहुँच वादा करता हूँ. हालांकि, मिट्टी microbiome अभी भी काफी हद तक बड़े डालने पुस्तकालय उत्पादन के लिए पर्याप्त गुणवत्ता की उच्च आणविक भार डीएनए प्राप्त करने में कठिनाई के कारण चुनौती बनी हुई है. यहाँ हम मिट्टी और अवसादों से उच्च आणविक भार है, माइक्रोबियल समुदाय जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल परिचय. अलग जीनोमिक डीएनए की गुणवत्ता बहाव के अनुक्रमण और स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए बड़े डालने पर्यावरण जीनोमिक पुस्तकालयों के निर्माण के लिए आदर्श है.
प्रक्रिया सेल lysis के साथ शुरू होता है. सेल दीवारों और रोगाणुओं की झिल्ली (पीस) यांत्रिक और रासायनिक दोनों बलों (β-mercaptoethanol) द्वारा lysed हैं. जीनोमिक डीएनए तो निष्कर्षण बफर, क्लोरोफॉर्म - isoamyl शराब और isopropyl शराब का उपयोग करने के लिए अलग है. lysis और निष्कर्षण कदम के लिए कार्यरत बफ़र्स guanidine आइसोथियोसाइनेट और hexadecyltrimethylammonium (CTAB) ब्रोमाइड उच्च आणविक भार जीनोमिक डीएनए की अखंडता की रक्षा शामिल हैं. अपने बहाव के आवेदन पर निर्भर करता है, अलग जीनोमिक डीएनए आगे सीज़ियम (CSCL) क्लोराइड ढाल ultracentrifugation है, जो कम कर देता है दोष humic एसिड सहित का उपयोग कर शुद्ध कर सकते हैं. पहली प्रक्रिया है, निकासी, डीएनए की मात्रा का ठहराव कदम को छोड़कर लगभग 8 घंटे लगते हैं. CSCL ढाल ultracentrifugation, एक दो दिन की प्रक्रिया है. पूरी प्रक्रिया के दौरान जीनोमिक डीएनए धीरे इलाज किया जाना चाहिए करने के लिए बाल काटना को रोकने के लिए, गंभीर vortexing बचने के लिए, और दोहराव कठोर pipetting.
Protocol
भाग मैं: डीएनए का निष्कर्षण
प्रक्रिया
1. 8 घंटे, 6 डीएनए की मात्रा का ठहराव को छोड़कर नमूने के प्रसंस्करण के लिए आवश्यक हैं.
इससे पहले कि आप निकासी शुरू, तुम पूर्व सर्द मूसल मोर्टार, और एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रंग या तरल नाइट्रोजन का उपयोग करने के लिए की आवश्यकता होगी. इसके अलावा, पूर्व ठंडा बर्फ पर 50 मिलीलीटर 20 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म isoamyl शराब (24:1) युक्त ट्यूबों. 65 से संकरण ओवन सेट ° पूर्व गर्मी सी. CTAB समाधान की जाँच करें, अगर यह 60 डिग्री सेल्सियस क्रिस्टल पिघला करने के लिए गर्म सघन है. पिछले सामग्री जोड़ने, बस से पहले आप निष्कर्षण (देखें नीचे नुस्खा) शुरू द्वारा पूरा denaturing समाधान और निष्कर्षण बफर. एक धूआं हुड में सभी निष्कर्षण प्रक्रियाओं आचरण.
2. Denaturing बफर और निष्कर्षण बफर तैयार.
नोट: डीएनए उपज को अधिकतम करने के लिए, यह ठीक निर्देशों का पालन बफ़र्स करने के लिए महत्वपूर्ण है.
3. एक पूर्व ठंडा मोर्टार में 2 मिट्टी की छ रखें.
नोट: क्षेत्र में एकत्र मिट्टी सूखी बर्फ पर परिवहन के लिए जमे हुए किया जाना चाहिए और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत पिघलना और चलनी 2 मिमी चलनी का उपयोग डीएनए निष्कर्षण से पहले मिट्टी. आप 10 जी अप करने के लिए मिट्टी के शुरू राशि में वृद्धि कर सकते हैं
4. मिट्टी का हल denaturing के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
5. रुक और तरल एन में मिट्टी पीसने दो एक पैर का उपयोग कर जब तक मिट्टी के कणों ख़स्ता और समरूप देखो. ठंड और पीस दो बार दोहराएँ.
नोट: मिट्टी के दौरान जमी नमूना रखें पीस, पर्याप्त तरल नाइट्रोजन का उपयोग करने के लिए पूरी तरह से मिट्टी के नमूने को कवर. पीसने के दौरान थोड़ा सा पिघलने स्वीकार्य है.
6. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार एक पूर्व ठंडा रंग का उपयोग ट्यूब जमीन मिट्टी स्थानांतरण.
नोट: जमीन मिट्टी नमूना -80 डिग्री सेल्सियस इस बिंदु पर, यदि आवश्यक पर भंडारित किया जा सकता है.
7. निष्कर्षण बफर के 9 मिलीलीटर जोड़ें. समाधान और मिट्टी, कम गति पर भंवर संक्षिप्त मिश्रण.
नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए बफर सजातीय है, यह 60 पर गर्म ° उपयोग करने से पहले 10-15 मिनट के लिए सी. 60 डिग्री सेल्सियस पर निकासी भर बफर के बाकी रखें. 8 गति से भंवर (पैमाने पर जहां 10 अधिकतम).
8. एक संकरण ओवन में 65 ° सी में 40 मिनट के लिए सेते हैं. ऊष्मायन के दौरान लगातार कम गति पर ट्यूबों घुमाने के लिए, या धीरे ट्यूबों हर 10 मिनट पलटना.
नोट: ट्यूब क्षैतिज एक संकरण ओवन में बफर एक बड़े सतह क्षेत्र पर मिट्टी संपर्क करने के लिए अनुमति देने के प्लेस. समाधान ऊष्मायन के दौरान एक सा चिपचिपा लग सकता है.
9. 14 डिग्री सेल्सियस - 10 बजे 10 मिनट के लिए 1800 x जी, पर अपकेंद्रित्र पूर्व ठंडा 50 मिलीलीटर शंक्वाकार 20 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म isoamyl शराब (24:1) युक्त ट्यूब में स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला, बर्फ पर रहते हैं.
नोट: जब आप स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला, कार्बनिक परत (नीचे की परत) को परेशान नहीं सावधान रहना. अगर यह आवश्यक है क्रम में करने के लिए केवल स्वच्छ सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा सतह पर तैरनेवाला के 1-2 मिली छोड़ो. आप अक्सर सतह पर तैरनेवाला के शीर्ष पर एक बेज रंग परत (मोटाई में लगभग 1-3 मिमी) देख सकते हैं. जब सतह पर तैरनेवाला एकत्रित इस परत को परेशान मत करो. ट्यूब की दीवार के साथ टिप स्लाइड इस बेज रंग परत का टूटना को रोकने की कोशिश करो. यदि सतह पर तैरनेवाला turbid भी है, शराब क्लोरोफॉर्म isoamyl निष्कर्षण सतह पर तैरनेवाला पर एक बार दोहराएँ. डिस्पोजेबल प्लास्टिक pipettes उपयोग जब स्थानांतरित क्लोरोफॉर्म, के रूप में क्लोरोफॉर्म प्लास्टिक पिघल जाएगा मत करो. एक गिलास पिपेट का उपयोग करें, या एक गिलास सिलेंडर स्नातक की उपाधि प्राप्त की, या क्लोरोफॉर्म 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सीधे डाल.
10. मिट्टी गुटिकाओं 2 गुना अधिक निकालें;
10.1. मिट्टी छर्रों 5 मिलीलीटर निष्कर्षण बफर जोड़ें, धीरे मिश्रण 1 मिलीलीटर कम गति पर संक्षिप्त vortexing द्वारा पीछा टिप का उपयोग.
नोट: शेक और उपयोग करने से पहले बफर मिश्रण.
10.2. 65 में ° संकरण ओवन में 10 मिनट के लिए सी सेते हैं. 14 डिग्री सेल्सियस - 10 बजे 10 मिनट के लिए 1800 x जी, पर अपकेंद्रित्र
ट्यूब के लिए 9 कदम पर सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण. एकत्र सतह पर तैरनेवाला और क्लोरोफॉर्म - isoamyl शराब के साथ ट्यूब निकासी के दौरान बर्फ पर रखें.
नोट: यकीन है कि तुम पार नमूने के बीच मिश्रण के बिना एक ही ट्यूब सतह पर तैरनेवाला जोड़ने.
10.3. 9.1 और 9.2 एक और अधिक समय दोहराएँ.
11. एक rotating प्लेट का उपयोग करना, बहुत धीरे ट्यूब है कि एकत्र की सतह पर तैरनेवाला (14-19 मिलीलीटर) और क्लोरोफॉर्म - isoamyl 1.25 rpm पर 10 मिनट के लिए शराब शामिल रॉक.
नोट: बंद ढक्कन बहुत कस रिसाव को रोकने के. कमाल की थाली पर एक कागज तौलिया लेटाओ इससे पहले कि आप ट्यूब जगह तो किसी भी लीक आसानी से पता लगाया जा सकता है.
12. 14 डिग्री सेल्सियस - 10 बजे 20 मिनट के लिए 1800 x जी, पर अपकेंद्रित्र
13. एक नया ट्यूब जलीय चरण स्थानांतरण.
नोट: जलीय चरण (ऊपर परत) और कार्बनिक परत (नीचे के बीच interphase परेशान नहींपरत) जब आप स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला. लगभग 1.5 2 मिलीलीटर केवल स्वच्छ सतह पर तैरनेवाला के संग्रह को सुनिश्चित करने के लिए सतह पर तैरनेवाला छोड़ो.
14. डीएनए isopropyl शराब (- 21.a 15.a कदम) का उपयोग कर पुनर्प्राप्त. वैकल्पिक रूप से, Amicon उपयोग ® अल्ट्रा 15 केन्द्रापसारक फ़िल्टर डिवाइसेज (15.b कदम - 21.b) अगर आप अपने नमूना में बायोमास के बहुत ही कम राशि है, जो isopropyl शराब वर्षण है कि ठीक करने के लिए मुश्किल है से शायद ही दिखाई गोली का उत्पादन होगा उम्मीद है.
15.a. एक नया ट्यूब ultracentrifuge सतह पर तैरनेवाला रखें.
16.a. 0.6:1 का एक मात्रा के अनुपात में एकत्र की सतह पर तैरनेवाला पर isopropyl शराब जोड़ें. ट्यूबों उलटें धीरे से एक बार कुछ मिश्रण करने के लिए.
17.a कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
18.a. 25 डिग्री सेल्सियस - 20 में 20 मिनट के लिए 16000 एक्स जी, पर अपकेंद्रित्र सभी ट्यूबों के वजन centrifugation कदम से पहले अच्छी तरह से संतुलित कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
नोट: ट्यूब पर केन्द्रापसारक बल की दिशा मार्क, तो आप अधिक आसानी से डीएनए गोली का पता लगाने जब डीएनए उपज कम है.
19.a. Decanting या वैक्यूम suctioning द्वारा isopropyl शराब निकालें. डीएनए गोली परेशान नहीं सावधान रहो.
नोट: जैसे ही centrifugation पूरा हो गया है isopropyl शराब निकालें. डीएनए गोली नहीं खोना बहुत सावधान रहें. डीएनए गोली के आकार व्यापक रूप से भिन्न मिट्टी के प्रकार के आधार पर, एक स्पष्ट रूप से दिखाई (~ 9 मिमी व्यास) से शायद ही दिखाई कर सकते हैं. यह ट्यूब की दीवार के साथ ध्यान इतना suctioning के रूप में नहीं डीएनए गोली बाहर चूषण द्वारा isopropyl शराब के अवशेषों को हटाने की सिफारिश की है.
20.a. कमरे के तापमान पर 5 के लिए सूखी डीएनए गोली - 20 मिनट.
नोट: सूखी डीएनए गोली से अधिक मत करो, अन्यथा यह मुश्किल हो करने के लिए डीएनए redissolve.
21.a. 200 μl ते में डीएनए गोली Resuspend. यह कोमल दोहन द्वारा मिक्स. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में डीएनए समाधान स्थानांतरण. 4 में ट्यूब रखें डिग्री सेल्सियस क्रम में डीएनए के लिए पूरी तरह से भंग रातोंरात.
नोट: गोली के आकार पर निर्भर करता है, तुम ते की मात्रा को समायोजित करने के लिए जोड़ सकते हैं. आमतौर पर 200 - ते के 400 μl अच्छी तरह से काम करता है.
* वैकल्पिक रूप से कदम 15.b का पालन - 21.b.
15.b. एक ® Amicon अल्ट्रा-15 केन्द्रापसारक फ़िल्टर डिवाइसेज पूर्व धोने, डिवाइस और 3500 x जी पर अपकेंद्रित्र 15 मिलीलीटर ते 10 मिनट के लिए, जोड़ने . प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
16.b. डीएनए 13 कदम से पूर्व धोया Amicon फिल्टर करने के लिए समाधान रखें. 3500 x जी पर अपकेंद्रित्र जब तक डीएनए की मात्रा 200 से कम है - 500 μl. प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
17.b. ते के साथ डीएनए दो बार धो, Amicon फिल्टर उपकरणों के लिए 10 मिलीलीटर ते जोड़ने. 3500 x जी पर अपकेंद्रित्र जब तक डीएनए की मात्रा लगभग 200 μl से कम है . प्रवाह के माध्यम से त्यागें. एक बार दोहराएँ.
18.b. फिल्टर पर एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब डीएनए समाधान स्थानांतरण.
19.b. Amicon फिल्टर करने के लिए 40 μl ते जोड़ें. Pipetting और नीचे के क्रम में करने के लिए फ़िल्टर पर किसी भी डीएनए अवशेषों ठीक से फिल्टर झिल्ली के दोनों ओर से धो लें. ट्यूब के लिए कदम 18.b. पर इस धोने समाधान जोड़ें
20.b. यदि आवश्यक हो, डीएनए आगे Microcon ® Ultracel YM 30-केन्द्रापसारक फ़िल्टर यूनिट द्वारा केंद्रित किया जा सकता है, 10000 एक्स जी पर 7 मिनट के लिए 200 μl ते और centrifuging जोड़कर फ़िल्टर पूर्व धोने. फिल्टर और 1 मिनट के लिए 5000 x जी पर अपकेंद्रित्र डीएनए समाधान जोड़ें. Centrifugation दोहराएँ जब तक फ़िल्टर पर डीएनए समाधान की राशि 50 μl के लिए लगभग कम.
नोट: Microcon फ़िल्टर के लिए प्रारंभिक नमूना मात्रा अधिकतम 500 μl है. 14000 एक्स जी से अधिक गति पर अपकेंद्रित्र मत अपकेंद्रित्र अधिक झिल्ली dries जब तक पूरी तरह से मत करो. सुनिश्चित करें कि कुछ तरल अभी भी centrifugation के बाद फिल्टर को शामिल किया गया है. यदि आप पर centrifuged झिल्ली और शुष्क है, फिर 15 μl ते जोड़ने के लिए, 30 सेकंड के लिए धीरे आंदोलन, और 21.b. कदम आगे बढ़ना
21.b. फिल्टर यूनिट 1000 में एक नया Microcon ट्यूब और अपकेंद्रित्र 3 से डीएनए पुनर्प्राप्त मिनट के लिए XG में उल्टा प्लेस.
22. यों TAE जेल द्वारा डीएनए (0.8%, 0.5xTAE, 4 घंटे के लिए 50 वी), और Nanodrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या पिको - हरे रंग की परख और प्लेट रीडर के द्वारा.
नोट: डीएनए राशि मार्कर बैंड के लिए जेल पर जाना जाता है एकाग्रता (उच्च आणविक डीएनए मार्कर या λHindIII) के साथ नमूना बैंड की तुलना द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है.
23. उच्च आणविक भार 1%, 1xTAE जेल के साथ स्पंदित फील्ड जेल वैद्युतकणसंचलन (PFGE) का उपयोग कर (अधिक जानकारी के लिए द्वितीय चरण देखते हैं, part2 पर डीएनए की अखंडता की जाँच करें https://www.jove.com/index/details.stp?id 1387 = , doi: Taupp एट अल द्वारा 2009 10.3791/1387).
नोट: आप कम पिघलने agarose के बजाय इस QC उद्देश्य के लिए नियमित रूप से agarose जेल का उपयोग कर सकते हैं. संक्षेप में, वैद्युतकणसंचलन शर्तों निम्नानुसार हैं: 2-2केबी 50, 6 वोल्ट, प्रारंभिक स्विचन समय: 5 सेकंड, अंतिम स्विचन समय: 15 सेकंड, 14 में 12 घंटे के लिए चलाने के डिग्री सेल्सियस SYBR गोल्ड एक घंटे के लिए जेल पर डीएनए कल्पना धुंधला.
24. यदि निकाले डीएनए की आणविक भार संतोषजनक रहे हैं, तो निम्नलिखित CSCL ढाल अपकेंद्रित्र कदम के लिए आगे बढ़ना. वैकल्पिक रूप से, डीएनए -20 डिग्री सेल्सियस या -80 में संग्रहीत किया जा सकता डिग्री सेल्सियस CSCL अपकेंद्रित्र से पहले.
डीएनए के औसत आकार के बराबर हो सकता है या 36 KB से अधिक चाहिए, यदि आप एक बड़े डालने metagenomic डीएनए पुस्तकालय का निर्माण करना चाहते हैं.
भाग द्वितीय. डीएनए सीज़ियम क्लोराइड ढाल ultracentrifugation का उपयोग कर शुद्धि
अपकेंद्रित्र की तैयारी: 1,5 - 2 घंटे
Centrifugation कदम: 18 घंटे
Ethidium ब्रोमाइड (EtBr) को हटाने और ध्यान केंद्रित centrifugation के बाद डीएनए: 3 घंटे
प्रक्रिया
इस जानकारी के लिए, राइट एट अल संदर्भ लें . 2009 https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352 , doi: 10.3791/1352
प्रतिनिधि परिणाम / परिणाम
वन मिट्टी कार्बनिक के 2 जी (का. क्षितिज) और खनिज (ऐ, अटल बिहारी, और बीटी क्षितिज) क्षितिज (लॉन्ग टर्म मिट्टी (LTSP) उत्पादकता Skulow झील, ई.पू., कनाडा में स्थित साइट से नमूना से अलग जीनोमिक डीएनए की कुल राशि और ईसा पूर्व वन और रेंज के मंत्रालय द्वारा प्रबंधित) 10 मिलीग्राम से 180 मिलीग्राम से लेकर. 60 केबी (चित्रा 1) - पृथक डीएनए की औसत आकार 40 के बीच आमतौर पर था. 260 nm/280 एनएम पर absorbance के अनुपात 1.3-1.6 के बीच किया गया था और 230 एनएम पर एक चोटी है, जो अक्सर मिट्टी के नमूने में मनाया humic एसिड संदूषण संकेत हो सकता है. CSCL ढाल centrifugation काफी इस संदूषण कम और भी 1.8 से 260/280 के अनुपात में वृद्धि हुई - 1.9 के रूप में चित्रा 2a और 2b में दिखाया गया है.
चित्रा 1. PFGE CSCL ultracentrifugation पहले निकाले जीनोमिक डीएनए के चित्रों. lane1: 1 केबी मार्कर 100 एनजी, 2 लेन: λHind III मार्कर 100 एनजी, 3 लेन: λHind III मार्कर 250 एनजी, 4 लेन: λHind III मार्कर 500 एनजी, lane5: Fosmid 36 केबी मार्कर 100 एनजी, 6 लेन और 7: जीनोमिक खनिज मिट्टी क्षितिज ऐ, 8 लेन और 9 से पृथक डीएनए: जीनोमिक LTSP Skulow झील, ई.पू. स्थित साइट पर खनिज मिट्टी क्षितिज अटल बिहारी से पृथक डीएनए
जीनोमिक डीएनए के चित्रा 2. Chromograms पहले स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा पता लगाया (ए) और CSCL ultracentrifugation (बी) के बाद. CSCL ultracentrifugation, जो जीनोमिक डीएनए की गुणवत्ता में सुधार का संकेत के बाद 230 एनएम तरंगदैर्ध्य absorbance के मूल्य में कमी नोट. कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 2 का एक बड़ा संस्करण देख.
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Acknowledgments
हम वन मिट्टी उत्पादकता के चल रहे अध्ययन का समर्थन करने के लिए अभिनव, ब्रिटिश कोलंबिया ज्ञान विकास कोष, जीनोम ब्रिटिश कोलंबिया और ब्रिटिश कोलंबिया के वन मंत्रालय और रेंज के लिए कनाडा फाउंडेशन धन्यवाद देना चाहूंगा. SL तुला नींव वित्त पोषित माइक्रोबियल विविधता और विकास के लिए केंद्र से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| *Denaturing solution: 10 ml in total | |||
| Guanidine isothiocyanate (MW 118.16), 4.73 g | |||
| 1M Tris-HCl (pH 7.0), 100 μl | |||
| 0.5M EDTA, 20 μl | |||
| Add water to 9.95 ml in total. | |||
| Autoclave. | |||
| Add 50 μl 2-mercapt–thanol just before use. (5 μl of 2-mercapt–thanol per 1 ml Denaturing Solution) | |||
| Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C. Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use. | |||
| **Extraction Buffer | |||
| 1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*, 100 ml | |||
| 1M Tris-HCl [pH 7.0], 100 ml | |||
| 0.5M EDTA [pH 8.0], 200 ml | |||
| 5 M NaCl, 300 ml | |||
| Autoclave and keep it at room temperature. | |||
| Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. | |||
| * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 | |||
| Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended. | |||
References
- Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation. JoVE. , (2009).
- Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large insert environmental genomic library production. J Vis Exp. , (2009).
