Summary
Protocol
合計骨髄の準備
- 四B6マウスを屠殺し、脛骨、大腿骨、股関節と背骨を取得するために解剖されています。
- 解剖時には、手足や骨は、PBS、2％FCS熱不活性化に保管されています（オプションの2mMのEDA - 解剖の培地を）。
- きれいな骨は、解剖の培地で乳鉢と乳棒で粉砕されています。それを行うための効率的な方法は、同時に、各マウスの脛骨、大腿骨と腰、2つのスパインを粉砕することです。
- 各マウスから得られた細胞混合物は、別個のままと50mlのファルコンチューブに40μmのフィルターで濾過する。この方法では、それぞれのチューブは、マウス、および2つのスパインから得られた混合物の半分のすべての脚の骨から得られた細胞の混合物が含まれています。この段階では、フィルタは、骨の破片を区切るために使用されます。
- それは、2または3回白（無骨髄付き）骨片、および脊椎のフラグメントを得るために二脚の骨を粉砕するために、通常はお勧めです。
- それらがバランスのとれた持つようにチューブをいっぱいにし、5分の1200rpmを回転。
- 上清を吸引し、チューブのラック（このステップは、塊の形成と細胞の損失を最小限に抑えるために、各遠心分離後に重要である）にチューブをドラッグしてペレットを緩めます。あなたが系統の枯渇を行っている場合は、1 mlのPBS 2％FCS（現在は上からのNO EDTA）で各チューブを再懸濁し、またはそうでなければあなたのための便利などんなボリュームになります。
リネージュの枯渇
- この手順では、幹細胞および前駆細胞の濃縮、高度に分化した細胞を除去し、細胞の非常に不均一な集団を得ることができます。あなたがHSCソートされている場合、このステップでは、大幅にそのためのソート時間を短縮し、あなたがより高い数値を得ることができるように、マウスの数が多いからHSCを整理できるように、セルソーティングを通過する必要のセルの数を減らすことができます単一のソートでHSC。
- 後でソートする場合は、（未染色とSCA1、c - Kitの、CD48、Flk2単色のコントロール）コントロールをソートするための細胞混合物の50μlのを（私は通常、各チューブからビットを取る）を取る。
- 林のカクテル30ml/tubeを追加。リネージュのカクテルは、残念ながら研究室から研究室に少しの変更抗体の様々な、含まれています。スカデンの研究室では、我々はB220 GR1に対するbiotinilated抗体、TER119、CD4、CD8、CD3を、使用してください。染色の最終的な希釈は1:700です。
- ミックス、および4℃で15分間インキュベートしてすぐにボルテックス℃に
- インキュベーションの間、列の下の磁石と15ミリリットル溶出チューブにカラムを準備する。ドガいくつかPBSはsteriflipフィルタを（あなたが真空吸引によるPBSの表面に向かって移動する小さな気泡を参照してください）を使用し、各列に3ミリリットル脱気したPBSを適用することにより、カラムを平衡化します。
- カラム流量は1ml/5min程度なので、使用する準備が列を持って約15分かかります。
- インキュベーションの終了時に、管を埋め、1200rpmで5分間スピンダウンするPBS、2％FCSを追加します。
- 上清を吸引、ペレットを緩めし、1ml / PBSを脱気チューブに再懸濁します。
- 後でソートする場合、（15ミリリットル、各チューブからビット）シングルカラー染色CTRLリネージュ合計骨髄を取り出してください。
- 迅速ストレプトアビジンビーズ30ml/tube、ボルテックスミキシング、そして4℃で15分間インキュベートする℃に追加
- インキュベーションの終了時に、脱気したPBSを2ml /チューブを追加。列の下に新しいコレクションチューブを入れ、カラムに各懸濁液を適用し、40μmのフィルターを通して濾過。
- それを洗浄する各チューブに脱気したPBSの別の3 mlを加え。列が空になったら、同じ40μmのフィルターを使用して再度適用する。
- 溶出液は、系統枯渇した細胞の混合物、茎および前駆細胞の濃縮不均一な集団が含まれています。プール2チューブに4管の内容。 1500RPMで5分間スピン。
- 上清を吸引除去する。ペレットは、白または主に白のはずです。もしそうでなければご都合の良い任意のボリュームに再懸濁し、後でソートする場合にペレットを緩めて、1ミリリットル合計PBS、2％FCSでそれらを一緒に懸濁します。
LKSまたは長期HSCのソート
- 単一のカラー染色CTRL（15ミリリットル）枯渇系統を取り出す。これは、系統の枯渇の効率を評価することができます。
- ソートの細胞混合物を15ミリリットルチューブに染色される。
抗体を追加します。
| SCA PE - Cy5.5 | 1：100 | 10ミリリットル |
| キットAPC | 1:100 | 10ミリリットル |
| SA PE - Cy7 | 1:500 | 2ミリリットル |
長期HSCをソートするには、また追加します。
| CD48 FITC | 1:1000 | 1ミリリットル |
| Flk2 PE | 1:200 | 5ミリリットル |
また、解剖や総骨髄系統で染色した後、脇に保た合計骨髄を使用して、単一の染色のコントロールを用意する。これらstainingsは、FACSチューブに直接行うことができます。
暗闇に存在することを確認してください！
- 渦はすぐ℃で20〜30分間、C、再ミキシング半分の方法によって4で混合し、インキュベートする。
- 抗体の過剰を洗い流すために、1500rpmで5分間PBS 2％FCSとスピンでチューブを埋める。
- 上清を除去する、すべてのペレットを再懸濁し、フィルタキャップで新しいFACSチューブに移動します。それは、これらのフィルタを通過する細胞を得るためにしばらく時間がかかるかもしれない、そしてそれは、フィルターを洗浄し、細胞の損失を最小限に抑えるために、その後いくつかのより多くのPBSを適用することが重要です。このステップでは、すべてのセルソーターのユーザーの最悪の悪夢であるソーター、目詰まりを回避するために必要である。
- 細胞選別施設へのあなたの細胞を渡すとき、また、細胞を回収するPBS 10パーセントHI FCSでチューブを準備することを確認してください。
- あなたがLKS細胞を選別している場合は、HSCおよび多能性前駆細胞を再読込み長期と短期を含む不均一な集団を取得します。平均利回りは、4匹から30万LKSです。
- また、CD48とFlk2抗体を使用している場合には、長期HSC、短期のHSCとMPPの各集団を分離することができます。 LT - HSCは、最も稀な集団である。平均利回りは、4匹から60,000〜50,000程度の細胞です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
