Aislamiento y trasplante de células madre hematopoyéticas (HSC)

Summary

Protocol

Ósea total de preparación de la médula

1. Cuatro ratones B6 son sacrificados y disecados para obtener tibias, fémures, la cadera y la columna vertebral.
2. Durante las disecciones, las extremidades y los huesos se mantienen en PBS el 2% de FCS inactivado por calor (opcional EDA 2 mm - medio disección).
3. Los huesos limpios se trituran con mortero en medio de la disección. Una manera eficiente de hacerlo es aplastar a la tibia, el fémur y cadera de cada ratón, y luego dos espinas a la vez.
4. La mezcla de células obtenidas de cada ratón se mantiene separada y se filtra a través de un filtro de 40μm en un tubo de 50 ml de halcón. De esta manera, cada tubo contiene la mezcla de células obtenidas de todos los huesos de las patas de un ratón, y la mitad de la mezcla obtenida a partir de 2 espinas. En esta etapa, el filtro se utiliza para separar fragmentos de hueso.
5. Por lo general se recomienda para aplastar a los huesos de las piernas dos veces para obtener blanco (sin médula ósea) fragmentos de hueso y los fragmentos de la columna 2 o 3 veces.
6. Llenar los tubos para que ellos equilibrada, y el giro 1200rpm 5 min.
7. Aspirar el sobrenadante y aflojar el sedimento arrastrando los tubos en el soporte de tubos (este paso es importante después de cada centrifugación para minimizar la formación de grupo y la pérdida de células). Resuspender cada tubo en 1 ml de PBS 2% de FCS (NO EDTA a partir de ahora) si usted está haciendo el agotamiento de linaje, o en el volumen que es de otra manera conveniente para usted.

Lineage agotamiento

1. Este procedimiento le permite eliminar las células altamente diferenciadas y obtener una población muy heterogénea de células, enriquecida de las células madre y progenitoras. Si usted está ordenando HSC, este paso reduce drásticamente el número de células que tienen que pasar por la clasificación de células, por lo tanto, reduciendo el tiempo de clasificación y lo que le permite ordenar HSC de un mayor número de ratones, para que pueda obtener un mayor número de HSC en una clasificación única.
2. Si usted va a ordenar más tarde, saque 50μl de la mezcla de células (por lo general toman un poco de cada tubo) para la clasificación de los controles (sin manchas y Sca1, c-Kit, CD48, Flk2 controles de un solo color).
3. Añadir 30ml/tube Lin cóctel. Cóctel linaje contiene una variedad de anticuerpos, que por desgracia cambia un poco de un laboratorio a otro. En el laboratorio Scadden, que utilizan anticuerpos contra biotinilado Gr1, Ter119, CD4, CD8, CD3, B220. Su dilución final en la tinción es 1:700.
4. Vortex rápidamente a la mezcla y se incuba durante 15 min a 4 ° C.
5. Durante la incubación, preparar las columnas de los imanes y los tubos de 15 ml de elución en las columnas. Degas algunos PBS utilizando un filtro steriflip (debería ver pequeñas burbujas de aire en movimiento hacia la superficie de la aspiración al vacío debido a la PBS), y equilibrar las columnas mediante la aplicación de 3 ml desgasificado PBS a cada columna.
6. El flujo de la columna es de unos 1ml/5min, por lo que tarda unos 15 minutos para que las columnas listas para usar.
7. Al final de la incubación, añadir PBS 2% de FCS para llenar los tubos y centrifugar durante 5 minutos a 1200rpm.
8. Aspirar el sobrenadante, afloje los pellets y resuspender en 1 ml / tubo de desgasificado PBS.
9. Si usted está ordenando posteriormente, sacar la médula ósea del linaje de un solo color tinción ctrl (15 ml, un poco de cada tubo).
10. Añadir 30ml/tube cuentas estreptavidina vórtice, de forma rápida para mezclar e incubar durante 15 min a 4 ° C.
11. Al final de la incubación, añadir 2 ml / tubo de desgasificado PBS. Poner nuevos tubos de recogida en las columnas, y se aplican cada suspensión a una columna, filtrado a través de un filtro de 40μm.
12. Añadir otro 3 ml de desgasificado PBS a cada tubo para lavarlo. Una vez que las columnas están vacías, se aplican de nuevo utilizando el filtro de 40μm mismo.
13. El eluido contiene el linaje agotado mezcla de células, una población heterogénea enriquecido para células madre y progenitores. La piscina del contenido de los 4 tubos en 2 tubos. Girar durante 5 min a 1500 rpm.
14. Aspirar el sobrenadante. La pastilla debe ser blanco o negro, principalmente. Afloje los pellets y resuspender juntos en 1 ml de PBS FCS total de 2% si está ordenando más tarde, de lo contrario volver a suspender en el volumen que sea conveniente para usted.

LKS o la clasificación de largo plazo, HSC

1. Saque el linaje de un solo color agotado tinción ctrl (15 ml). Esto le permitirá evaluar la eficacia de su agotamiento linaje.
2. La mezcla de células de tipo se tiñe en el tubo de 15 ml.

Añadir los anticuerpos:

Sca-PE Cy5.5	1: 100	10ml
Kit de APC	1:100	10ml
SA PE-Cy7	1:500	2 ml

Para ordenar HSC a largo plazo, también se suman:

CD48 FITC	1:1000	1 ml
Flk2 PE	1:200	5 ml

También, preparar tinción solo los controles mediante la médula ósea total de mantenerse a un lado después de la disección y el teñido de la médula ósea total de linaje. Estas coloraciones se puede hacer directamente en los tubos de FACS.

Asegúrese de estar en la oscuridad!

1. Vortex rápidamente para mezclar e incubar a 4 ° C durante 20 a 30 minutos, volver a mezclar a mitad de camino.
2. Para quitar el exceso de anticuerpos, se llenan los tubos con PBS 2% de FCS y girar durante 5 min a 1500 rpm.
3. Extraer el sobrenadante, resuspender todas pellets y pasar a nuevos tubos con tapas de filtro de FACS. Puede ser que tome un tiempo para obtener las células que pasar por estos filtros, y es importante aplicar un poco más de PBS después de lavar el filtro y minimizar la pérdida de células. Este paso es necesario para evitar la obstrucción de la clasificadora, que es la peor pesadilla de todos los usuarios de clasificador de células.
4. Cuando la entrega de sus células de la planta de clasificación de células, asegúrese de preparar también un tubo con PBS 10% de FCS HI donde las células se recogieron.
5. Si usted está ordenando las células LKS, obtendrá una población heterogénea que contiene a largo plazo y corto repoblar progenitores HSC y multipotentes. Un rendimiento promedio es de 300.000 LKS de 4 ratones.
6. Si usted también ha usado CD48 y Flk2 anticuerpos, puede separar cada población de células madre hematopoyéticas a largo plazo, HSC a corto plazo y MPP. LT-HSC son la población más raros. Un rendimiento promedio es de unos 50.000 a 60.000 células de 4 ratones.