Isolamento e trapianto di cellule staminali emopoietiche (CSE)

Summary

Protocol

Totale preparazione del midollo osseo

1. Quattro B6 topi sono sacrificati e sezionato per ottenere tibie, femori, dell'anca e della colonna vertebrale.
2. Durante la dissezione, le membra e le ossa sono conservate in PBS 2% di FCS inattivato (opzionale 2mM EDA - medio dissezione).
3. Le ossa pulite sono schiacciato con mortaio e pestello in media dissezione. Un modo efficace per farlo è quello di schiacciare tibie, femori e fianchi di ogni mouse, quindi 2 spine alla volta.
4. La miscela di cellule ottenute da ogni mouse viene tenuto separato e filtrata attraverso un filtro 40μm in un tubo da 50 ml falco. In questo modo, ogni tubo contiene la miscela di cellule ottenute da tutte le ossa delle gambe di un topo, e la metà della miscela ottenuta da 2 spine. In questa fase, il filtro viene utilizzato per separare i residui delle ossa.
5. Di solito è consigliabile schiacciare le ossa delle gambe due volte per ottenere bianco (senza midollo osseo) frammenti ossei, ed i frammenti della colonna 2 o 3 volte.
6. Riempire i tubi per farli equilibrata, e spin 1200rpm 5 min.
7. Aspirare il supernatante e sciogliere il pellet trascinando i tubi sul rack tubo (questo passaggio è importante dopo ogni centrifugazione per ridurre al minimo la formazione di gruppo e la perdita di cellule). Risospendere ogni tubo in 1 ml di PBS 2% FCS (NO EDTA d'ora in poi), se si sta facendo esaurimento lignaggio, o in qualunque altro volume è conveniente per voi.

Lineage esaurimento

1. Questa procedura consente di eliminare le cellule altamente differenziate e di ottenere una popolazione molto eterogenea di cellule, arricchito di cellule staminali e progenitrici. Se siete ordinamento HSC, questo passaggio di ridurre drasticamente il numero di cellule che devono passare attraverso la separazione delle cellule, riducendo così il tempo di ordinamento e che consente di tipo HSC da un maggior numero di topi, in modo che si può ottenere un maggior numero di HSC in un singolo ordinamento.
2. Se avete intenzione di ordinare poi, togliere 50μl di miscela cella (di solito prendere un po 'da ogni tubo) per l'ordinamento controlli (senza macchia e SCA1, c-kit, CD48, Flk2 controlli singolo colore).
3. Aggiungi 30ml/tube cocktail Lin. Cocktail di lignaggio contiene una varietà di anticorpi, che cambia, purtroppo, un po 'da un laboratorio all'altro. Nel laboratorio Scadden, usiamo gli anticorpi contro biotinilated Gr1, Ter119, CD4, CD8, CD3, B220. Loro diluizione finale la colorazione è 1:700.
4. Vortex rapidamente per mescolare, e incubare per 15 minuti a 4 ° C.
5. Durante l'incubazione, preparare le colonne i magneti e tubi 15ml eluizione sotto le colonne. Degas alcuni PBS utilizzando un filtro steriflip (dovreste vedere bollicine d'aria in movimento verso la superficie della causa di aspirazione a vuoto PBS), ed equilibrare le colonne mediante l'applicazione di 3 ml degasato PBS a ciascuna colonna.
6. Il flusso della colonna è di circa 1ml/5min, così ci vogliono circa 15 minuti per avere le colonne pronto all'uso.
7. Al termine della incubazione, aggiungere PBS 2% FCS per riempire i tubi e spin down per 5 min a 1200rpm.
8. Aspirare il surnatante, allentare il pellet e risospendere in 1 ml / tubo degassificato PBS.
9. Se siete ordinamento successivamente, estrarre il midollo osseo totale Lineage ctrl singolo colore colorazione (15 ml, un po 'da ogni tubo).
10. Aggiungi streptavidina 30ml/tube perline, vortice di mescolare velocemente, e incubare per 15 minuti a 4 ° C.
11. Al termine della incubazione, aggiungere 2 ml / tubo di degassificato PBS. Mettere provette di nuovo sotto le colonne, e applicare ogni sospensione a una colonna, filtrando attraverso un filtro 40μm.
12. Aggiungere altri 3 ml di PBS degasato a ciascuna provetta per lavarla. Una volta che le colonne sono vuote, si applica di nuovo con lo stesso filtro 40μm.
13. L'eluato contiene la miscela di cellule impoverito lignaggio, una popolazione eterogenea arricchito di staminali e cellule progenitrici. Piscina il contenuto dei 4 tubi in 2 tubi. Spin per 5 minuti a 1500rpm.
14. Aspirare il surnatante. Il pellet deve essere bianco o prevalentemente bianco. Allentare il pellet e risospendere insieme in 1ml PBS totale del 2% FCS se siete ordinamento più tardi, altrimenti risospendere in qualsiasi volume è conveniente per voi.

LKS o lungo termine ordinamento HSC

1. Estrarre lignaggio impoverito colorazione ctrl singolo colore (15 ml). Questo vi permetterà di valutare l'efficienza del vostro esaurimento lignaggio.
2. La miscela di cellule per ordinare è macchiato nel tubo 15ml.

Aggiungi anticorpi:

Sca PE-Cy5.5	1: 100	10ml
Kit APC	1:100	10ml
SA PE-Cy7	1:500	2ml

Per ordinare HSC lungo termine, anche aggiungere:

CD48 FITC	1:1000	1 ml
Flk2 PE	1:200	5ml

Inoltre, preparare colorazione singolo controlli utilizzando il midollo osseo totale tenuto da parte dopo la dissezione e il totale del midollo osseo colorate lignaggio. Queste colorazioni può essere fatto direttamente in tubi di FACS.

Assicurarsi di essere al buio!

1. Vortex rapidamente per mescolare e incubare a 4 ° C per 20 a 30 minuti, rimescolamento a metà.
2. Per lavare via l'eccesso di anticorpi, riempire i tubi con PBS 2% FCS e spin per 5 min a 1500 giri al minuto.
3. Rimuovere il surnatante, risospendere tutti i pellet e spostarli in nuovi tubi FACS con tappi filtro. Si potrebbe prendere un po 'per le cellule di passare attraverso questi filtri, ed è importante applicare un po' più PBS dopo per lavare il filtro e ridurre al minimo la perdita di cellule. Questo passaggio è necessario per evitare l'intasamento del selezionatore, che è il peggior incubo di ogni utente cell sorter.
4. Al momento della consegna il tuo celle per l'impianto di separazione delle cellule, assicuratevi di preparare anche una provetta con PBS 10% HI FCS dove le cellule verranno raccolti.
5. Se siete l'ordinamento delle cellule LKS, si ottiene una popolazione eterogenea che contiene a lungo termine e di breve termine ripopolamento progenitori HSC e multipotenti. Una resa media è di 300.000 LKS da 4 topi.
6. Se avete usato anche CD48 e Flk2 anticorpi, è possibile separare ciascuna popolazione di HSC lungo termine, HSC a breve termine e MPP. LT-HSC sono la popolazione più rare. Una resa media è di circa 50.000 a 60.000 celle da 4 topi.