अलगाव और hematopoietic स्टेम सेल का प्रत्यारोपण (HSCs)

Summary

Protocol

कुल अस्थि मज्जा की तैयारी

1. चार बी -6 चूहों बलिदान और tibias, femurs कूल्हे और रीढ़ प्राप्त dissected.
2. Dissections के दौरान, अंग और हड्डियों पीबीएस FCS 2% निष्क्रिय गर्मी में रखा जाता है (वैकल्पिक 2mm EDA - विच्छेदन मध्यम).
3. साफ हड्डियों और विच्छेदन के माध्यम से मोर्टार और मूसल के साथ कुचल कर रहे हैं. एक कुशल तरीका यह करना एक समय में tibias, femurs और प्रत्येक माउस के कूल्हों, तो 2 कांटा को कुचलने के लिए है.
4. सेल प्रत्येक माउस से प्राप्त मिश्रण अलग रखा जाता है और एक 50ml बाज़ ट्यूब में एक 40μm फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर्ड. इस तरह, प्रत्येक ट्यूब सेल माउस, और 2 कांटा से प्राप्त मिश्रण के आधे के सभी पैर की हड्डियों के बाहर प्राप्त मिश्रण होता है. इस स्तर पर, फ़िल्टर करने के लिए हड्डी मलबे को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
5. यह आमतौर पर पैर की हड्डियों को कुचलने के दो बार सफेद को प्राप्त करने के लिए (कोई अस्थि मज्जा के साथ) की हड्डी टुकड़े उचित है, और रीढ़ की हड्डी टुकड़े 2 या 3 बार.
6. ट्यूबों भरें उन्हें संतुलित है, और 5 मिनट 1200rpm स्पिन.
7. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और ट्यूब रैक (प्रत्येक के लिए पेड़ों का झुरमुट गठन और सेल हानि कम से कम centrifugation के इस कदम के बाद महत्वपूर्ण है) पर ट्यूबों खींचकर गोली ढीला. 1 मिलीलीटर पीबीएस FCS 2% (सं EDTA अब से) में प्रत्येक ट्यूब Resuspend अगर आप वंशावली रिक्तीकरण कर रहे हैं, या जो कुछ भी मात्रा में अन्यथा आप के लिए सुविधाजनक है.

वंश रिक्तीकरण

1. यह प्रक्रिया आप अत्यधिक विभेदित कोशिकाओं को खत्म करने और कोशिकाओं के एक बहुत ही विषम जनसंख्या प्राप्त स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए अनुमति देता है. यदि आप HSC छँटाई कर रहे हैं, इस कदम काफी कोशिकाओं है कि सेल छँटाई के माध्यम से जाना है की संख्या कम कर देता है, इसलिए छँटाई समय को कम करने और आप HSC सॉर्ट करने के लिए चूहों के एक उच्च संख्या के बाहर है, ताकि आप एक उच्च की संख्या प्राप्त कर सकते हैं अनुमति देता है एक एकल छँटाई में HSC.
2. यदि आप बाद में सॉर्ट करने के लिए जा रहे हैं, बाहर नियंत्रण छँटाई (बेदाग और Sca1, सी किट, CD48, Flk2 एकल रंग नियंत्रण) के लिए सेल मिश्रण (मैं आमतौर पर प्रत्येक ट्यूब से एक बिट लेने) के 50μl ले.
3. लिन कॉकटेल 30ml/tube जोड़ें. वंश कॉकटेल एंटीबॉडी के एक किस्म है, जो दुर्भाग्य से प्रयोगशाला से प्रयोगशाला के लिए एक छोटे से परिवर्तन होता है. Scadden प्रयोगशाला में, हम के खिलाफ GR1 biotinilated एंटीबॉडी Ter119, सीडी 4, सीडी 8, CD3, B220 उपयोग करें. उनकी धुंधला में अंतिम कमजोर पड़ने 1:700 है.
4. भंवर जल्दी मिश्रण, और 4 में 15 मिनट के लिए सेते ° सी.
5. ऊष्मायन के दौरान, और स्तंभों के तहत मैग्नेट 15ml elution ट्यूब पर स्तंभों को तैयार है. देगास कुछ पीबीएस steriflip फिल्टर (आप कम हवा वैक्यूम आकांक्षा के कारण पीबीएस की सतह की ओर बढ़ बुलबुले देखना चाहिए) का उपयोग कर, और प्रत्येक स्तंभ के लिए 3ml degassed पीबीएस लागू करने के द्वारा स्तंभों को संतुलित करना.
6. स्तंभ प्रवाह 1ml/5min के बारे में है, तो यह बारे में 15 मिनट लगते का उपयोग करने के लिए तैयार कॉलम.
7. ऊष्मायन अंत में, Pbs 2% FCS जोड़ने के लिए ट्यूबों भरने और 1200rpm पर 5 मिनट के लिए नीचे स्पिन.
8. सतह पर तैरनेवाला Aspirate, छर्रों को ढीला और 1 मिलीग्राम / पीबीएस degassed ट्यूब में resuspend.
9. यदि आप बाद में छँटाई कर रहे हैं, एकल रंग धुंधला हो जाना ctrl वंश कुल अस्थि मज्जा (15ml, प्रत्येक ट्यूब से एक बिट).
10. Streptavidin मोती 30ml/tube, जल्दी भंवर मिश्रण करने के लिए, और 4 में 15 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस जोड़ें
11. ऊष्मायन अंत में, 2 मिलीग्राम / degassed पीबीएस के ट्यूब में जोड़ें. स्तंभों के तहत नए संग्रह ट्यूब रखो, और एक स्तंभ के प्रत्येक निलंबन लागू होते हैं, एक 40μm फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टरिंग.
12. इसे धोने के लिए प्रत्येक ट्यूब degassed पीबीएस का एक और 3 मिलीलीटर जोड़ें. स्तंभ खाली हैं, एक बार फिर वही 40μm फिल्टर का उपयोग कर लागू है.
13. eluate वंश समाप्त सेल मिश्रण, एक विषम और स्टेम progenitors और कोशिकाओं के लिए समृद्ध आबादी शामिल हैं. सामग्री 2 ट्यूबों में 4 ट्यूबों के पूल. 1500rpm पर 5 मिनट के लिए स्पिन.
14. सतह पर तैरनेवाला Aspirate. गोली सफेद या मुख्य रूप से सफेद होना चाहिए. छर्रों को ढीला करने और उन्हें 1ml कुल पीबीएस 2% FCS में एक साथ resuspend यदि आप बाद में छँटाई कर रहे हैं, अन्यथा मात्रा जो भी आप के लिए सुविधाजनक है में resuspend.

LKS या लंबी अवधि के HSC छँटाई

1. समाप्त एकल रंग धुंधला हो जाना ctrl (15ml) वंश बाहर ले जाओ. यह आप अपने वंश कमी की क्षमता का आकलन करने की अनुमति देगा.
2. सॉर्ट करने के लिए सेल मिश्रण 15ml ट्यूब में दाग है.

एंटीबॉडी जोड़ें:

SCA पीई - Cy5.5	1: 100	10ml
किट APC	1:100	10ml
पीई - Cy7 SA	1:500	2ml

लंबी अवधि के HSC सॉर्ट करने के लिए, भी जोड़:

CD48 FITC	1:1000	1ml
Flk2 पीई	1:200	5ml

इसके अलावा, एक धुंधला तैयार कुल अस्थि मज्जा विच्छेदन और कुल अस्थि मज्जा वंश दाग के बाद अलग रखा का उपयोग नियंत्रण. ये stainings FACS ट्यूबों में सीधे किया जा सकता है.

अंधेरे में होना सुनिश्चित करें!

1. भंवर मिश्रण जल्दी है और 4 बजे ° सी 20 से 30 मिनट के लिए, पुनः मिश्रण आधा रास्ता के माध्यम से सेते हैं.
2. एंटीबॉडी से अधिक दूर धोने, 1500 rpm पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों भरने पीबीएस 2% FCS और स्पिन के साथ.
3. सतह पर तैरनेवाला निकालें, सभी छर्रों resuspend और नए FACS ट्यूबों के लिए उन्हें फिल्टर टोपी के साथ कदम. यह एक समय लेने के लिए कोशिकाओं को पाने के लिए इन फिल्टर के माध्यम से जाना, हो सकता है, और यह महत्वपूर्ण है कुछ पीबीएस अधिक बाद में लागू करने के लिए फिल्टर धोने और सेल नुकसान को कम. यह कदम सॉर्टर के clogging से बचने के लिए आवश्यक है, जो हर कोशिका सॉर्टर उपयोगकर्ता के दुःस्वप्न है.
4. जब बाहर सौंपने सेल छँटाई की सुविधा के लिए अपनी कोशिकाओं, भी पीबीएस 10% हाई FCS जहां कोशिकाओं को एकत्र किया जाएगा के साथ एक ट्यूब तैयार करने के लिए सुनिश्चित करें.
5. यदि आप LKS कोशिकाओं छँटाई कर रहे हैं, तो आप एक विषम जनसंख्या दीर्घकालिक और छोटी अवधि HSC और multipotent progenitors repopulating युक्त प्राप्त करेंगे. एक औसत उपज 4 चूहों से 300,000 LKS है.
6. यदि आप भी CD48 और Flk2 एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया है, तो आप लंबी अवधि के HSC, अल्पावधि HSC और MPP के प्रत्येक आबादी को अलग नहीं कर सकता. LT-HSC आबादी सबसे दुर्लभ हैं. एक औसत उपज 4 चूहों से 50,000 के बारे 60,000 कोशिकाओं है.