Summary
Прямой впрыск внутриядерных кДНК является эффективным методом трансфекции для пост-митозе. Этот метод обеспечивает высокий уровень экспрессии гетерологичных белка из одного или нескольких кДНК конструкций и позволяет функции белка, чтобы быть изучены в соответствующих физиологически среде с различными одного анализов клеток.
Abstract
Первичная нейронных клеточных культур являются ценным инструментом для изучения функции белка, так как они представляют собой более биологически соответствующие системы по сравнению с увековечены клеточных линий. Тем не менее, пост-митотического природа первичных нейронов, препятствует эффективному гетерологичной экспрессии белка с помощью обычных процедур, таких как электропорации или химически-опосредованной трансфекции. Таким образом, другие методы должны быть использованы для того, чтобы эффективно выражать белков в этих не делящихся клеток.
В этой статье мы опишем шаги, необходимые для выполнения внутриядерных инъекции кДНК конструкции в диссоциированных взрослых симпатических нейронов. Эта техника, которая была применена для различных типов нейронов, может успешно вызвать гетерологичной экспрессии белка. Оборудования, необходимого для микроинъекции процедура включает в себя инвертированный микроскоп для визуализации клеток, пипетки стеклянные инъекции заполнены кДНК решение, которое связано с N 2 (г) системы доставки давления и микроманипулятора. Микроманипулятора координаты инъекции движения микроинъекции пипетки с краткого импульса под давлением N 2, чтобы извлечь кДНК раствор из пипетки чаевые.
Эта техника не имеет токсичность, связанная со многими другими методами трансфекции и позволяет нескольким конструкции ДНК, которые будут высказаны на последовательное отношение. Низкое число вводили клетки делает микроинъекции процедура хорошо подходит для одного исследования клеток, таких как электрофизиологических записей и оптических изображений, но не может быть идеальным для биохимических анализов, которые требуют большего количества клеток и более высокую эффективность трансфекции. Хотя внутриядерных микроинъекций потребует инвестиций в оборудование и время, способность достичь высокого уровня экспрессии гетерологичных белка в физиологически соответствующих среды делает этот метод очень полезным инструментом для исследования функции белка.
Protocol
I. Подготовка к инъекции
В этом разделе описываются предварительные шаги, которые должны быть приняты до инъекционных кДНК в ядре нейронов. Процедура изоляции нейронов выходит за рамки данной статьи, но важно, чтобы нейроны распадается на отдельные клетки и придерживаясь хорошо, чтобы нижняя поверхность 35 мм блюда культуры клеток (см. обсуждение за полезные советы для достижения этой цели). Хотя различные нейроны потенциально могут быть использованы, периферических ганглиях, таких как верхних шейных ганглиев (SCG) или спинной ганглий корень являются предпочтительными для вскрытия, так как они удобно доступной и выход большого числа нейронов. Дополнительные преимущества использования SCG нейронов, что они являются относительно однородной популяции клеток и хорошо характеризуется 1,2,3,4.
А. Подготовка плазмиды кДНК для инъекций
- Для предотвращения порчи или поломки ДНК, перчатки следует надевать во время подготовки.
- ДНК, кодирующую белок интерес субклонировали в подходящий вектор млекопитающих выражения, такие как PCI (Promega, Madison, WI), под регулирование высоко и конститутивно цитомегаловирус (ЦМВ) промоутера. Если белок не помечены, репортера плазмиды, кодирование EGFP например (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Пало-Альто, Калифорния), совместно с впрыском для подтверждения успешной закачки и выражения. ДНК выделяли с использованием высокой колонне разделения качества (например, QIAfilter Midi-приготовительные комплекта Qiagen, Chatsworth, Калифорния) и далее очищают с использованием центробежного фильтра блок с PVDF фильтр (0,1 мкм, Millipore, Bedford, MA) для удаления частиц в плазмидной ДНК, которая может затруднить введение пипец во время процесса впрыска. Плазмиды хранятся при температуре -20 ° С при концентрации около 1 мкг / мкл в соответствующий буфер хранения ДНК (например, TE буфера: 10 мМ Tris, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0).
- Непосредственно перед микроинъекции, плазмиды кДНК разводят и перемешивают до желаемой конечной концентрации в ТЕ буфере или H 2 O. Как правило, 5-10 нг / мкл репортер гена достаточно для обозначения вводили клетки, и полная концентрация кДНК для инъекций не должна превышать 200 нг / мкл с ДНК вязкой при высоких концентрациях и может забить инъекции пипец. Небольшой объем кДНК для инъекций (5-10 мкл) получают путем смешивания капель раствора на чистую поверхность небольшой кусочек парафильмом (сторона под бумажной основе). Смешайте капель раствора вместе pipeting вверх и вниз несколько раз pipetor и избежать введения пузырьков воздуха в процессе перемешивания.
- Использование кончиком пипетки microloader (Эппендорф, Brinkmann Instruments, Westbury, Нью-Йорк), передачи кДНК решение специально подготовленные гематокрита трубки (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания). Смотрите материалы раздела Инструкции по подготовке труб гематокрита (Материалы таблицу). Место гематокрита трубки, содержащей кДНК инъекционного раствора в 1,5 трубки микроцентрифужных мл.
- Центрифуга трубки в течение 15-30 мин при 10 000 г в микроцентрифужных оснащен фиксированным углом или качается ведро ротора (Eppendorf), при комнатной температуре (20-24 ° С) для осаждения частиц в кДНК решение, которое может блокировать микроинъекции пипетки. КДНК инъекционного раствора можно хранить при комнатной температуре в течение инъекции сессии.
Б. Изготовление инъекции пипец
- Одноразовые пипец микроинъекции стекла имеются в продаже (например, Femtotips, Eppendorf), которые удобно, но дорого ($ 10 за микроинъекции пипетки). Инъекция пипец может быть изготовлен в лаборатории с использованием программируемых Р-97 Flaming Браун съемник пипетки (Саттер Instrument Company, Новато, Калифорния) и filamented, тонкостенные боросиликатного стекла капилляров (инструменты Всемирного Precision, Сарасоте, штат Флорида). Этот вариант является более экономически эффективным и позволяет управлять микроинъекции форму пипетки и размера.
- Двухступенчатая программа используется для узкого тянуть советы пипетки микроинъекции. С момента открытия микроинъекции пипец слишком узок, чтобы изучить под световым микроскопом, качество инъекции пипец должны быть оценены непосредственно путем введения нескольких клеток до настройки программы завершена. Следующие приблизительные параметры тепла, тянуть, скорости и времени: (тяга 1) 600, 115, 15, 250; (тянуть 2) 640, 130, 65, 200. Эти параметры меняются в зависимости от различных партий стекла и по условию нагрева нити в съемника, и должны быть скорректированы по мере необходимости. Для получения дополнительной информации см. 5.
- Потяните несколько (2-5) инъекций пипец на чашку нейронов для инъекций, в случае повреждения или проблемы во время инъекции сессии. Магазин инъекции пипец в закрытой емкости, чтобы предотвратить попадание пыли кончиком пипетки микроинъекции.
II. Внутриядерных микроинъекции
палатке "> В этом разделе подробно процесс инъекционных кДНК в ядре нейронов. микроинъекции основные настройки включает в перевернутой фазово-контрастной микроскопии (например, Nikon Diaphot TMD, Nikon, Мелвилл, штат Нью-Йорк) для визуализации процесса, микроманипулятора (например, Eppendorf 5171), чтобы контролировать движение инъекции пипетки и давление инжектора (например, Eppendorf FemtoJet Express) изгнать кДНК решение от пипетки. Подключение давления инжектор микроманипулятора позволяет синхронизацию Последние два процесса во время инъекции. Другие обязательным, но настоятельно рекомендуется, компоненты включают в себя установленный системой видеонаблюдения (CCD камера, Cohu Inc, Сан-Диего, Калифорния; черно-белый видеомонитор, Sony Corporation, Токио, Япония). Эта система не является обязательным требованием для инъекций; Однако, черно-белый монитор обеспечивает более высокую контрастность для улучшения визуализации в ядро клетки и предлагает более комфортной работы во время длительных сеансов инъекций. Кроме того, портативный компьютер под управлением программного обеспечения для работы ручной контроллер может быть использован для полу- автоматизировать процесс инжекции (см. Обсуждение право).Идеальное время для введения SCG нейронов составляет 3-6 часов после диссоциации. На данном этапе клетки имеют сферическую форму, плотно прикреплена к нижней части блюда, и ядро отчетливо видно, под фазово-контрастной микроскопии, в качестве центрального круглого органелл с темной оболочкой, содержащие один или несколько ядрышек (рис. 1А).
- Место блюдо диссоциированных нейронов в центре столик микроскопа. Настройте фокус и оптимизации фазового контраста оптики микроскопа так ядрах нейронов, четко видны.
- Внесите 2 мкл кДНК подготовлено решение в микроинъекции пипетки использованием наконечника microloader пипетки. Избегайте составления решения в нижней части трубки гематокрита, так как это может активизироваться частиц, которые поселились во время центрифугирования. Нити в микроинъекции пипец должно помочь в разработке решения кончик, но если маленькие пузырьки воздуха не проходят, мягко Флик стороне стекла, чтобы выбить их.
- Вставьте микроинъекции пипетки в капилляр обладатель давление инжектора и закрепите держатель микроманипулятора. Держатель крепится под углом 45 °.
- Нижняя микроинъекции пипетки на блюдо. Как пипетка входит культуральной среде, образуется мениск, который влияет на преломление света и снижает качество изображения нейронов. Чтобы решить эту проблему, башни фазе кольца можно слегка компенсировать до ядрах нейронов четко видимым.
- Некоторые системы давление впрыска у "чистых" функций, которая применяется максимальное давление воздуха из кончика пипетки микроинъекции на короткое время. Используйте эту функцию, чтобы очистить пипетка мусора перед началом и во время инъекции, если кончик появляется забиты. Если развеял жидкости не видно на экране при использовании этой функции, замените ее на новую пипетку инъекции.
- Центр микроинъекции пипетки в просмотре монитора и выровнять кончика рядом нейронов и в той же фокальной плоскости, как ядрышко. Установить эту позицию в качестве нижней оси Z. ограничение на микроманипулятора. Эта позиция глубиной микроинъекции пипетки будет заранее, чтобы во время инъекции. Теперь положение кончика приблизительно 30 мкм выше этой точки так микроинъекции пипетки очищает верхней части нейронов.
- "Вводить" режим Эппендорф 5171 микроманипулятора может быть определено со следующими параметрами для выполнения внутриядерных инъекций. Инъекционные функция установлена на, в то время прокалывать функция была прервана. Диагонали инъекций (по х и г-ось) производит наименьшее количество повреждения клеток и таким образом осевой режим должен быть использован для инъекций. Скорость впрыска 300 мкм / с достаточно, и синхронизировать повышения давления при микроинъекции пипетки достигает заданного оси предела.
- Давление инжектора контроля количества кДНК решение вводится в ядре. В "автоматическом" режиме инъекции, доставка ДНК в установленное время и инициированный связано микроманипулятора. Давление впрыска (Pi) должен быть установлен в диапазоне от 100 до 200 гектопаскалях (гПа; 1 гПа ~ 0,015 фунтов на квадратный дюйм); выше давление впрыска не улучшаются показатели эффективности и качества инъекций и может указывать на другие проблемы с кончика пипетки микроинъекции размера или ДНК чистоты . Впрыска (TI) в размере 0,3 с и компенсации давления (PC) от 30 гПа, которая обеспечивает постоянное положительное давление, чтобы избежать вступления окклюзии частиц из культуральной среды в пипетку наконечник, должны быть использованы.
- Позиция нейрона, который будет введен под кончиком пипетки микроинъекции использованием ху оси стадии микроскопа контроля. Совместите кончика пипетки над центром ядра, сосредоточив внимание туда и обратно между тОн наконечник и ядрышки.
- Inject ядра, нажав кнопку вводят (на микроманипулятора). Для инъекций шаг, движение пипетки микроинъекции и освобождение кДНК решения контролируются микроманипулятора. Трудно подтвердить успешное внутриядерных инъекции на глаз, но инъекции относительно низкой вязкостью кДНК решение (по сравнению с вязкой ядерной окружающей среды), часто появляется в виде белого шлейфа под фазово-контрастной оптики и может быть использован как индикатор инъекции в ядре. Иногда микроинъекции пипетки не проникает ядерной мембраны и просто толкает ядро. Вторая попытка инъекции в том же положении может привести к успешной инъекции ДНК в ядре. Отек ячейки, как правило, свидетельствует о непреднамеренном цитоплазматической инъекции. Кроме того, значительную ядерную опухоль не очень хорошо переносится нейронов и обычно приводит к гибели клеток вскоре после этого, таким образом, давление впрыска и продолжительность не должна превышать рекомендуемые значения.
- Продолжить инъекционные нейронов путем перестановки столике микроскопа для выравнивания следующего нейрона при микроинъекции пипетки. Систематически перемещаться по блюду придать примерно 50-100 ядер, прежде чем вернуться блюдо нейронов в инкубатор для инкубирования в течение ночи. Успешно вводят нейронов можно выделить следующий день выражение гена-репортера.
III. Представитель Результаты
Рисунок 1: верхний шейный ганглий (SCG) нейронов.
Фазового контраста образ SCG нейронов 3 часа после диссоциации (). На этом этапе ядро отчетливо видна, которая помогает выравнивание кончика пипетки микроинъекции. Ядре появляется в центре нейронов с одной (левой) или несколько (справа) темными ядрышками.
SCG нейронов 16 часов после инъекции EGFP кДНК в ядре (В). Левые, SCG нейронов рассматривается под фазово-контрастной подсветкой. Правильно, epifluorescent изображения тех же нейронов показывает успешный инъекции и в результате EGFP выражение в одном нейроне.
Белые шкалы составляет 20 мкм.
Рисунок 2: Цельноклеточная записи токов через heterologously выраженным G-белком внутренне исправления K + (GIRK) каналов из SCG нейронов.
GIRK токов (я GIRK) были вызваны 200 мс напряжение рампы от -140 до +40 мВ от проведения потенциал -60 мВ (вставка) после активации эндогенных α 2-адренорецепторов на норадреналина (NE, 10 мкм) . Наложенные следы записи из того же нейрона и указать ранее (черный) и после применения либо NE в одиночку (синий) или СВ плюс 10 мМ Ba 2 + (красный). Пунктирные линии показывают нулевой текущем уровне.
Для записи я GIRK, внешний раствор содержал (в мм) 130 NaCl, 5,4 KCl, 10 HEPES, 10 2 CaCl, 0,8 MgCl 2, 15 глюкоза, сахароза 15, 0,0003 и ТТХ, доводили до рН 7,4 с помощью NaOH. Внутреннее решение записи, содержащиеся (в мм) 135 KCl, 11 EGTA, 1 2 CaCl 2, MgCl 2, 10 HEPES, 4 MgATP и 0,3 Na 2 ГТФ, доводили до рН 7,2 с КОН.
Отсутствие текущих вызванными напряжением рампы в присутствии НЭ в uninjected нейроны SCG () показывает, что нейроны SCG не выражают эндогенных каналов GIRK. Успешное введение плазмиды кДНК, кодирующую функциональный GIRK канал 11 порождает большие токи при напряжении рампы при воздействии на северо-восток (B, слева). Токи имеют типичные характеристики токов через каналы GIRK: активация G-белком рецептор агонистов (NE), внутрь ректификации, и блок токов предполагаемого блокатор канала GIRK, Ba 2 + (B, правый след красного цвета). Открытые и наполнил кружки я GIRK в холдинг и пикового тока, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 2.
Discussion
Общие проблемы и предложения:
Как уже упоминалось ранее, успешное ядерное инъекции зависят от наличия клетки приверженцем пластины тканевой культуры. Отсрочка начала инъекции несколько часов после процедуры клеточной диссоциации позволяет нейронам придерживаться нижней части блюда. Кроме того, покрытие блюда с 0,1 мг / мл с высокой молекулярной массой поли-L-лизин (Sigma, Сент-Луис, Миссури) помогает адгезии нейронов к нижней поверхности посуды.
Закупорка микроинъекции пипец, особенно при попытке придать высокую концентрацию ДНК, могут быть частые проблемы. Использование высоких разделительных колоннах качества, чтобы изолировать и очищать плазмидной ДНК, а также выполнение дополнительных стадий очистки упоминается (спиновые фильтры, вращающиеся в трубах гематокрита) может помочь, чтобы удалить частицы до инъекций. Во время инъекции, "чистых" от давления инжектор может быть использован (по 0,2 с достаточно), но если это не помогает решить проблему, новый пипетки инъекции должна быть использована. Если большинство микроинъекции пипец засоряются во время инъекции сессии рассмотрит, изменяя настройки съемник пипетки стеклянные для получения советов микроинъекции пипетки с большим открытием.
Еще один вопрос, который возникает при ядерных инъекций неровности нижней поверхности блюда тканевой культуры. Эта изменчивость непосредственно влияет на точность целеуказания советов инъекции пипетки в ядро с глубины пипетка проходит во время инъекций не будет устранена. Таким образом, этот оси предел должен быть скорректированы в ходе инъекций в течение одной посуды. Это будет очевидно, когда корректировка необходима: не будет никаких признаков ядерной инъекций (не белый шлейф в ядре или ячейка пропустил полностью), или кончиком пипетки инъекции приближается к нижней части блюда (сжатие ячейки или даже сбой пипетки наконечник в нижней части блюда). Стекло-клонирование цилиндров (. OD 10 мм, № по 2090-01010, Bellco Стекло, Вайнленд, Нью-Джерси) может быть использована во время покрытия нейронов ограничить их в меньшие, более ограниченном пространстве, поэтому сведение к минимуму расстояние, необходимое для перемещения инъекции пипетки между инъекциями. Эти клонирования цилиндров удаляются до выполнения микроинъекций.
Недостатки метода:
Внутриядерных микроинъекции являются технически сложных, требующих терпения и высокой степенью ловкости рук оператора. Знание с этой техникой, как и любой другой навык, приходит с практикой. Таким образом, рекомендуется практиковать ядерное инъекции гена-репортера только перед тем, реальных экспериментах. Для оказания дальнейшей помощи инъекции процесса, это может быть возможным, чтобы консолидировать шаги микроманипулятора и давление инжектора в компьютерной программе. Такие программы, как Игорь Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, OR) могут быть использованы для хранения микроинъекции настройки и программировать многофункциональные контроллеры (ShuttlePro, Contour Design, Windham, NH), чтобы полу-автоматизировать процесс инжекции (см. 6,7,8 для подробности).
Еще одним недостатком внутриядерных техника микроинъекции увенчивается успехом. Примерно 10-20% попыток ядерной инъекции приводят к экспрессии белка. В то время эта эффективность может быть достаточно для приложений, которые не требуют большого количества клеток, экспрессирующих, электрофизиологии, например, для различных биохимических анализов это не может быть достаточным.
Применение методики:
Несмотря на все недостатки, внутриядерных микроинъекции ДНК является чрезвычайно полезным методом для выражения heterologously белков в нейронах.
Высокий уровень экспрессии белка достигается с ядерными микроинъекции из-за большого количества плазмид выпущен в ядро во время инъекции, высокой активностью ЦМВ промоутер регулирующих транскрипцию генов, и долго стабильность плазмид в ядре. Белки чрезмерное выражение особенно полезно в доминантно-негативного эксперименты, в которых высокий уровень гетерологичных белков требуется подавить эндогенного белка. Еще одно преимущество внутриядерных инъекций способность обеспечить последовательное доля кДНК конструкции для ядра, когда несколько конструкций вводятся. С другими методами трансфекции, трудно воспроизводимо ввести такой же пропорции каждого ДНК-конструкции в различные клетки в то же блюдо, а также между трансфекции. Прямой впрыск кДНК решение в ядро устраняет этот источник изменчивости и позволяет отношение выразили белки быть оттитрованы эффективно.
Традиционные методы трансфекции имеют ограниченную эффективность в пост-делящихся клеток из-за низкой включение ДНК в ядре 9 и химическая токсичность, связанная с трансфекции КГНродителей 10. Ядерная микроинъекций преодолеть эти проблемы путем введения генетического материала механически в ядре. Хотя этот метод является более сложным, возможность изучения влияния белка в функциональной биологической системы, в комплекте с эндогенными сигнальных путей, более чем компенсирует трудоемкость этого метода.
Все экспериментальные процедуры на животных были проведены в соответствии с Национальными институтами здравоохранения Руководство по уходу и использованию животных.
Acknowledgments
Наши лабораторные исследования при поддержке Внутренние программы исследований NIH, Национальный институт по злоупотреблению алкоголем и алкоголизму.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultrafree-MC Filter Unit | EMD Millipore | UFC30VV00 | Durapore PVDF filter; 0.1 μm pore-size |
| TE buffer | Quality Biological, Inc. | 351-010-131 | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0 |
| Micro-hematocrit capillary tubes | Fisher Scientific | 22-362-574 | Unheparinized Preparation: Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95°C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417 R | With a fixed angle or swinging-bucket rotor |
| Microloader 20 μl pipet tips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Microinjection capillary glass | World Precision Instruments, Inc. | TW120F-4 | Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | With platinum-iridium box filament (part # FB330B) |
| Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope | Nikon Instruments | 20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table | |
| Charge-coupled device (CCD) camera | Cohu Inc. | 6410 | |
| Video monitor | Sony Corporation | PVM-122 | Black and White, 9” screen |
| Micromanipulator system | Eppendorf | 5171 | |
| Microinjection Unit | Eppendorf | FemtoJet Express | |
| Microinjection controller | Contour Design | S-PROV2 | Programmable multimedia controller |
| Igor Pro | WaveMetrics | Version 4.05A | Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda |
References
- Eccles, J. C. The action potential of the superior cervical ganglion. J Physiol. 85, 179-206 (1935).
- Ikeda, S. R. Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein βγ subunits. Nature. 380, 255-258 (1996).
- Schofield, G. G., Ikeda, S. R. Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons. Brain Res. 485, 205-214 (1989).
- Schofield, G. G., Ikeda, S. R. Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons. Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).
- Dean, D. A. Chapter 4. Live Cell Imaging: a Laboratory Manual. Goldman, R. D., Spector, D. L. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 51-66 (2005).
- Ikeda, S. R. Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection. Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).
- Ikeda, S. R. Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection. Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).
- Ikeda, S. R., Jeong, S. W. Use of RGS-insensitive Gα subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons. Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30, 606-610 (2008).
- Vivaudou, M. Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants. J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).
