Summary
Inyección directa intranucleares de cDNA es una técnica eficaz para la transfección las células post-mitóticas. Este método proporciona altos niveles de expresión de proteínas heterólogas de construcciones de ADNc únicos o múltiples y permite la función de proteínas a estudiar en un ambiente fisiológicamente relevantes con una variedad de ensayos de células individuales.
Abstract
Cultivos primarios de células neuronales son herramientas valiosas para estudiar la función de la proteína, ya que representan un sistema biológicamente más relevantes, en comparación a las líneas de células inmortalizadas. Sin embargo, la naturaleza post-mitótica de las neuronas primarias impide la expresión efectiva de proteínas heterólogas utilizando procedimientos comunes como la electroporación o la transfección mediada químicamente. Así, otras técnicas se deben emplear para expresarse con eficacia las proteínas en estas células no se dividen.
En este artículo se describen los pasos necesarios para realizar las inyecciones intranucleares de las construcciones de cDNA en disociar las neuronas simpáticas de adultos. Esta técnica, que se ha aplicado a diferentes tipos de neuronas, con éxito puede inducir la expresión de proteínas heterólogas. El equipo esencial para el procedimiento de microinyección incluye un microscopio invertido para visualizar las células, una pipeta de inyección de vidrio llena con una solución de cDNA que está conectado a un N 2 (g) sistema de suministro de presión, y un micromanipulador. El micromanipulador coordina el movimiento de la inyección de una pipeta de microinyección con un breve pulso de presión de N 2 para expulsar solución de cDNA a partir de la punta de la pipeta.
Esta técnica no tiene la toxicidad asociada con muchos otros métodos de transfección y permite múltiples constructos de ADN que se expresa en una proporción constante. El bajo número de células inyectadas hace que el procedimiento de microinyección muy adecuado para estudios de células individuales, tales como registros electrofisiológicos y de imagen óptica, pero puede no ser ideal para los ensayos bioquímicos que requieren un mayor número de células y una mayor eficiencia de transfección. A pesar de microinyecciones intranucleares requerirá una inversión de equipo y el tiempo, la capacidad de alcanzar altos niveles de expresión de proteínas heterólogas en un ambiente fisiológicamente relevantes hace que esta técnica una herramienta muy útil para investigar la función de proteínas.
Protocol
I. Preparación para la inyección
Esta sección describe los pasos de preparación que deben tomarse antes de la inyección de cDNA en el núcleo de las neuronas. El procedimiento de aislamiento de las neuronas está fuera del alcance de este artículo, pero es importante que las neuronas disociadas en las células individuales y adherirse bien a la superficie inferior de 35 placas de cultivo celular mm (véase la discusión de consejos útiles para lograr esto). Aunque una variedad de diferentes neuronas podría ser utilizado, los ganglios periféricos, tales como los ganglios cervical superior (SCG) o los ganglios de la raíz dorsal son los preferidos para la disección, porque son de fácil acceso y el rendimiento de un gran número de neuronas. Otras ventajas de la utilización de las neuronas SCG es que son una población relativamente homogénea de las células y bien caracterizados 1,2,3,4.
A. Preparación del plásmido cDNA para la inyección
- Para evitar la contaminación o degradación del ADN, se deben usar guantes durante la preparación.
- ADN que codifica la proteína de interés se subclona en un vector de expresión adecuado de mamíferos, tales como PCI (Promega, Madison, WI), bajo el control del citomegalovirus muy activa y constitutiva (CMV). Si la proteína no está etiquetado, un plásmido reportero, EGFP codificación, por ejemplo (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), es co-inyección para confirmar el éxito de la inyección y la expresión. El ADN es aislado mediante una columna de separación de alta calidad (por ejemplo, QIAfilter Midi-prep kit, Qiagen, Chatsworth, CA) y se purifica aún más con una unidad de filtro centrífugo con un filtro PVDF (0,1 micras, Millipore, Bedford, MA) para eliminar las partículas en el preparación de plásmidos, que pueden obstruir las pipetas de inyección durante el proceso de inyección. Los plásmidos son almacenadas a -20 ° C a una concentración de aproximadamente 1 mg / l en un buffer de ADN de almacenamiento adecuado (por ejemplo, tampón TE: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0).
- Inmediatamente antes de la microinyección, ADNc del plásmido se diluyen y se mezcla con la concentración final deseada en buffer TE o H 2 O. Por lo general, 5-10 ng / l del gen reportero es suficiente para marcar a las células inyectadas, y la concentración total de cDNA para ser inyectado no debe superar los 200 ng / l ya que el ADN es viscoso en altas concentraciones y puede obstruir las pipetas de inyección. Un pequeño volumen de cDNA para la inyección (50 a 10 l) se prepara mezclando gotas de la solución sobre la superficie limpia de un pequeño trozo de Parafilm (lateral por debajo del soporte de papel). Mezclar las gotas de la solución, junto con pipeta hacia arriba y abajo varias veces con un pipetor y evitar la introducción de burbujas de aire durante la mezcla.
- Usando una punta de pipeta microloader (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), la transferencia de la solución de cDNA a un tubo de hematocrito especialmente preparado (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Vea la sección de materiales para obtener instrucciones sobre la preparación de los tubos de hematocrito (Tabla de Materiales). Coloque el tubo de hematocrito que contiene la solución inyectable de cDNA en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Centrifugar el tubo durante 15-30 min a 10 000 g en una microcentrífuga equipado con un rotor de cubeta de ángulo fijo o balanceo (Eppendorf), a temperatura ambiente (20-24 ° C) a las partículas de sedimento en la solución de cDNA que pueda bloquear las microinyección pipeta. La solución inyectable de ADNc se pueden mantener a temperatura ambiente durante la sesión de la inyección.
B. La fabricación de pipetas de inyección
- Pipetas desechables microinyección de vidrio están disponibles comercialmente (por ejemplo, Femtotips, Eppendorf), que son convenientes, pero caro ($ 10 por pipeta de microinyección). Pipetas de inyección se pueden fabricar en el laboratorio usando un P-97 programable extractor Flaming pipeta Brown (Empresa Sutter Instrument, Novato, CA) y filamented, de paredes delgadas tubos capilares de borosilicato (Instrumentos del Mundo de precisión, Sarasota, FL). Esta opción es más rentable y permite el control de la forma y el tamaño de pipeta de microinyección.
- Un programa de dos etapas se utiliza para tirar estrechas puntas de pipeta de microinyección. Desde la apertura de pipetas de microinyección es demasiado estrecho para examinarla bajo el microscopio de luz, la calidad de las pipetas de inyección tienen que ser evaluadas directamente mediante la inyección de unas pocas células antes de la configuración del programa se finalicen. Los siguientes son los valores aproximados para los ajustes de calor, la atracción, la velocidad y el tiempo: (la 1) 600, 115, 15, 250, (pull 2) 640, 130, 65, 200. Estos valores varían con diferentes lotes de vidrio y por la condición de que el filamento de calentamiento en el extractor, y debe ajustarse según sea necesario. Para más detalles véase el punto 5.
- Tire de varias (2-5) pipetas de inyección por plato de neuronas que se inyecta, en caso de daños o problemas durante la sesión de la inyección. Tienda de pipetas de inyección en un recipiente tapado para evitar que entre polvo en la punta de la pipeta de microinyección.
II. Microinyección intranucleares
tienda de campaña "> En esta sección se detalla el proceso de inyección de cDNA en el núcleo de las neuronas. Una microinyección de configuración básica incluye una fase invertida microscopio de contraste (por ejemplo, Nikon Diaphot TMD, Nikon, Melville, NY) para visualizar el proceso, micromanipulador (por ejemplo, Eppendorf 5171) para controlar el movimiento de la pipeta de inyección y una presión de inyección (por ejemplo, Eppendorf FemtoJet Express) para expulsar a la solución de cDNA a partir de la pipeta. Conexión de la presión de inyección para el micromanipulador permite la sincronización de los dos últimos procesos durante las inyecciones. Otros opcional, pero altamente recomendable, componentes incluyen un sistema de video vigilancia montado (cámara CCD, Cohu Inc., San Diego, CA, en blanco y negro monitor de vídeo, Sony Corporation, Tokio, Japón). Este sistema no es un requisito absoluto para inyecciones; Sin embargo, el monitor en blanco y negro ofrece un alto contraste para una mejor visualización del núcleo celular y ofrece una experiencia de visualización más cómoda durante las sesiones de inyección de largo. Además, un ordenador portátil con software para operar un controlador de mano se puede utilizar para semi- automatizar el proceso de inyección (véase la discusión para más detalles).El momento ideal para inyectar las neuronas SCG es de 3-6 horas después de la disociación. En esta etapa, las células son esféricas, muy bien fijadas a la parte inferior del plato, y el núcleo es claramente visible, con un microscopio de contraste de fase, como un centro de orgánulos ronda con una membrana oscura, que contiene una sola o múltiples nucleolos (Figura 1A).
- Coloque un plato de neuronas disociadas en el centro de la platina del microscopio. Ajustar el enfoque y optimizar la óptica de contraste de fase del microscopio de modo que el núcleo de las neuronas son claramente visibles.
- Pipeta de 2 l de solución preparada cDNA en una pipeta de microinyección con una punta de pipeta microloader. Que elaborar una solución en la parte inferior del tubo de hematocrito, ya que podría despertar las partículas que se establecieron durante la centrifugación. El filamento de la pipetas de microinyección debe ayudar en la elaboración de una solución a la punta, pero si persisten las pequeñas burbujas de aire, dé golpecitos en el lado del vidrio para desalojarlos.
- Inserte la pipeta de microinyección en el titular de la presión capilar de inyección y asegurar el soporte para el micromanipulador. El soporte se fija en un ángulo de 45 °.
- Baje la pipeta de microinyección en el plato. A medida que la pipeta entre en el medio de cultivo, el menisco se forma que afecta a la refracción de la luz y reduce la calidad de la imagen de las neuronas. Para aliviar este problema, la torre del anillo de fase puede ser ligeramente desplazado hasta el núcleo de las neuronas son claramente visibles de nuevo.
- Algunos sistemas de inyección a alta presión tienen una "limpia" la función que se aplica la presión máxima del aire de la punta de la pipeta de microinyección de un corto período. Utilice esta función para borrar la pipeta de escombros antes de comenzar y durante las inyecciones si la punta aparece tapado. Si el líquido disipado no es visible en la pantalla mientras se utiliza esta función, vuelva a colocar con una pipeta nueva inyección.
- El centro de la pipeta de microinyección en el monitor de visualización y alinear la punta al lado de una neurona y en el mismo plano focal que el nucléolo. Establecer esta posición como la más baja del eje z límite en el micromanipulador. Esta posición es la profundidad de la pipeta de microinyección avanzarán a durante las inyecciones. Ahora la posición de la punta de unos 30 m por encima de este punto para la pipeta de microinyección elimina la parte superior de las neuronas.
- El "inyectar" el modo de un micromanipulador Eppendorf 5171 se puede definir con los siguientes valores para realizar inyecciones intranucleares. La función de inyectar está activada, mientras que la función es atravesar la dejó. Un camino de inyección de diagonal (a lo largo del X y Z) produce la menor cantidad de daño celular, y por lo tanto el modo axial se debe utilizar para preparaciones inyectables. Una velocidad de inyección de 300 m / s es suficiente, y sincronizar la acumulación de presión cuando la pipeta de microinyección alcanza el conjunto del eje z límite.
- La presión de inyección controla la cantidad de solución de cDNA se inyecta en el núcleo. En el modo "automático" de la inyección, la entrega de ADN es controlada en el tiempo e iniciado por el micromanipulador conectado. La presión de inyección (Pi) se debe establecer entre 100 a 200 hectopascales (hPa, 1 hPa ~ 0,015 psi); mayores presiones de inyección no mejoran las tasas de éxito o la calidad de las inyecciones y puede indicar otros problemas con el tamaño de la microinyección de ADN punta de la pipeta o la pureza . Una duración de la inyección (TI) de 0,3 s y una compensación de presión (Pc), de 30 hPa, que suministra una presión positiva constante para evitar la entrada de oclusión de las partículas del medio de cultivo en la punta de la pipeta, se debe utilizar.
- Posición de la neurona que se inyecta debajo de la punta de la pipeta de microinyección con el microscopio de xy el eje de control de la etapa. Alinee la punta de la pipeta por encima del centro del núcleo, centrándose ida y vuelta entre tque la punta y el nucléolo.
- Inyectar el núcleo pulsando el botón de inyección (en el micromanipulador). Para el paso de la inyección, el movimiento de la pipeta de microinyección y el lanzamiento de la solución de cDNA son controlados por el micromanipulador. Es difícil confirmar el éxito inyecciones intranucleares a ojo, pero la inyección de la solución de viscosidad relativamente baja cDNA (en comparación con el medio ambiente nuclear viscoso), a menudo aparece como un penacho blanco bajo la óptica de contraste de fase y se puede utilizar como un indicador de inyección en el núcleo. A veces la pipeta de microinyección no penetra en la membrana nuclear y simplemente empuja el núcleo. Un intento de la segunda inyección en la misma posición puede conducir a un éxito de la inyección de ADN en el núcleo. Hinchazón de la célula es generalmente indicativo de la inyección citoplasmática no intencional. Además, la hinchazón significativa nuclear no es bien tolerado por las neuronas y generalmente resulta en la muerte celular poco después, por lo que la presión de inyección y la duración no debe superar los valores sugeridos.
- Continuar inyectando neuronas mediante el reposicionamiento de la platina del microscopio para alinear la siguiente neurona en la pipeta de microinyección. Sistemáticamente navegar a través de la antena para inyectar aproximadamente 50 a 100 núcleos antes de devolver el plato de las neuronas a la incubadora de incubación durante la noche. Neuronas con éxito inyectada puede ser identificado al día siguiente por la expresión del gen reportero.
III. Resultados representante
Figura 1: ganglio cervical superior (SCG), las neuronas.
La imagen de contraste de fase de las neuronas SCG 3 horas después de la disociación (A). En esta etapa, el núcleo se ve claramente que ayuda a la alineación de la punta de la pipeta de microinyección. El núcleo aparece en el centro de las neuronas con una sola (izquierda) o múltiples (derecha) nucleolos oscuros.
SCG neuronas 16 horas después de la inyección de EGFP cDNA en el núcleo (B). Izquierda, SCG neuronas se observa bajo la iluminación de contraste de fase. Derecha, imagen de epifluorescencia de las mismas neuronas que muestra la inyección con éxito y que resulta la expresión EGFP en una neurona.
Barra blanca escala es de 20 micras.
Figura 2: Plenario de células grabaciones de las corrientes a través de heteróloga-expresado acoplados a proteína G por dentro rectificación de K + (GIRK) canales de las neuronas SCG.
GIRK corrientes (I GIRK) fueron evocados por una rampa de voltaje de 200 ms -140 a 40 mV desde un potencial de mantenimiento de -60 mV (en el recuadro de la A) tras la activación endógena de α 2-adrenérgicos de norepinefrina (NE, 10 M) . Huellas superpuestas son las grabaciones de la misma neurona e indicar antes (negro) y después de la aplicación de cualquiera de NE solo (azul) o NE más de 10 mM Ba 2 + (rojo). Las líneas discontinuas indican el nivel actual de cero.
Para la grabación de I GIRK, la solución externa que contiene (en mM) 130 NaCl, 5,4 KCl, 10 HEPES, 10 de CaCl 2, 0,8 MgCl 2, 15 glucosa, sacarosa 15, y 0,0003 TTX, ajustada a pH 7,4 con NaOH. La solución de grabación interna contenía (en mM) 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 4 MgATP, y el 0,3 Na 2 GTP, ajustado a pH 7,2 con KOH.
La falta de corriente provocada por la rampa de tensión en la presencia de NE en las neuronas SCG no inyectadas (A) demuestra que las neuronas SCG no expresan canales GIRK endógeno. Inyección de éxito de un plásmido que codifica cDNA funcional GIRK canal 11 da lugar a grandes corrientes en la rampa de tensión cuando se expone al NE (B, izquierda). Corrientes tienen las características típicas de las corrientes a través de canales GIRK: la activación de un agonista de los receptores acoplados a proteína G (NE), rectificación hacia adentro, y el bloque de corrientes por el bloqueador del canal GIRK supuesto, Ba 2 + (B, derecha trazo rojo). Los círculos vacíos y llenos representan I GIRK en la explotación y el pico de corriente, respectivamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 2.
Discussion
Problemas comunes y sugerencias:
Como se mencionó anteriormente inyecciones, nuclear éxito dependerá de que las células adheridas a las placas de cultivo de tejidos. Aplazar el inicio de las inyecciones de un par de horas después del procedimiento de disociación de células permite que las neuronas se adhieren al fondo de los platos. Además, platos con revestimiento de 0,1 mg / ml de alto peso molecular de poli-L-lisina (Sigma, St. Louis, MO) la adhesión de las neuronas ayudas a la superficie inferior de los platos.
La obstrucción de pipetas de microinyección, especialmente cuando se trata de inyectar una alta concentración de ADN, puede ser un problema frecuente. Con alta calidad de las columnas de separación para aislar y purificar el ADN plásmido, y la realización de las etapas de purificación adicionales que se mencionan (filtros de giro, girar en los tubos de hematocrito) puede ayudar a eliminar las partículas antes de la inyección. Durante las inyecciones, la "limpia" en función de la presión de inyección se pueden utilizar (por 0,2 s es suficiente), pero si eso no resuelve el problema, una pipeta nueva inyección debe ser utilizado. Si la mayoría de las pipetas de microinyección se tapan durante una sesión de inyección, considerar la modificación de la configuración del extractor pipeta de vidrio para producir puntas de pipeta de microinyección con una abertura más grande.
Otra cuestión que se plantea durante las inyecciones nuclear es la irregularidad de la superficie inferior de placas de cultivo de tejidos. Esta variabilidad afecta directamente a la precisión de la focalización de las puntas de pipeta de inyección para el núcleo ya que la profundidad de la pipeta atraviesa durante las inyecciones es fijo. Por lo tanto, este límite del eje z debe ser ajustado durante el curso de las inyecciones en el mismo plato. Será evidente que un ajuste es necesario: no habrá ninguna indicación de la inyección nuclear (no penacho blanco en el núcleo de la célula o se pierde por completo), o la punta de la pipeta de inyección se aproxima a la parte inferior de la placa (la compresión de la célula o incluso chocar la punta de la pipeta en el fondo del plato). La clonación de vidrio cilindros (. OD 10 mm, Cat. N º 2090-01010, Bellco Glass, Vineland, NJ) se puede utilizar durante el forro de las neuronas para restringir en una más pequeña, la zona más limitada, por lo que minimiza la distancia necesaria para mover la pipeta de inyección entre las inyecciones. Estos cilindros de clonación se retiran antes de realizar microinyecciones.
Inconvenientes de la técnica:
Microinyecciones intranucleares son técnicamente exigentes, que requieren paciencia y un alto grado de destreza manual por el operador. Capacidad con esta técnica, al igual que con cualquier otra habilidad, viene con la práctica. Por lo tanto, se aconseja la práctica de inyecciones nuclear del gen reportero solo antes de intentar experimentos reales. Para ayudar aún más el proceso de inyección, puede ser posible para consolidar los pasos del micromanipulador y la presión de inyección en un programa de ordenador. Programas como Igor Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, Oregón) puede ser utilizada para almacenar la configuración de microinyección y programar los controladores multifuncionales (SHUTTLEPRO, Contour Design, Windham, Nueva Hampshire) para semi-automatizar el proceso de inyección (ver 6,7,8 para más detalles).
Otro de los inconvenientes de la técnica de microinyección intranucleares es la baja tasa de éxito. Aproximadamente el 10-20% de los intentos de inyecciones nuclear conducen a la expresión de proteínas. Mientras que la eficacia puede ser suficiente para las aplicaciones que no requieren un gran número de células que expresan, la electrofisiología, por ejemplo, para varios ensayos bioquímicos esto puede no ser suficiente.
Aplicaciones de la técnica:
A pesar de sus inconvenientes, la microinyección de ADN intranuclear es una técnica extremadamente útil para heteróloga la expresión de proteínas en las neuronas.
Los altos niveles de expresión de la proteína se logra con microinyecciones nuclear debido a la gran cantidad de plásmidos liberado en el núcleo durante las inyecciones, un promotor de CMV de gran actividad que regula la transcripción de genes, y la estabilidad a largo de los plásmidos en el núcleo. La sobre-expresión de proteínas es especialmente útil en el dominante negativo de los experimentos en los altos niveles de proteínas heterólogas están obligados a abrumar a la proteína endógena. Otra de las ventajas de las inyecciones intranucleares es la capacidad de entregar una parte consistente de las construcciones de cDNA para el núcleo que construye múltiples son inyectados. Con los métodos de transfección otra parte, es difícil introducir reproducible en la misma proporción de cada constructo de ADN en las células diferentes en el mismo plato y entre las transfecciones. Inyección directa de la solución de cDNA en el núcleo elimina esta fuente de variabilidad y permite que la proporción de proteínas que se expresan a titularse con eficacia.
Los métodos tradicionales tienen una eficacia limitada de la transfección en células post-mitóticas por baja incorporación de ADN en el núcleo 9 y la toxicidad química asociada con Reag transfecciónlos padres 10. Microinyecciones nuclear superar estos problemas mediante la introducción de material genético mecánica en el núcleo. Aunque esta técnica es más compleja, la capacidad de estudiar el efecto de una proteína en un sistema biológico funcional, con las vías de señalización endógena, más que compensa el carácter laborioso de esta técnica.
Todos los procedimientos experimentales en animales se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de las Directrices para el Cuidado de Animales y el empleo.
Acknowledgments
Nuestro laboratorio de investigación es apoyado por el Programa de Investigación Intramural del NIH, el Instituto Nacional sobre el Abuso de Alcohol y Alcoholismo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultrafree-MC Filter Unit | EMD Millipore | UFC30VV00 | Durapore PVDF filter; 0.1 μm pore-size |
| TE buffer | Quality Biological, Inc. | 351-010-131 | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0 |
| Micro-hematocrit capillary tubes | Fisher Scientific | 22-362-574 | Unheparinized Preparation: Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95°C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417 R | With a fixed angle or swinging-bucket rotor |
| Microloader 20 μl pipet tips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Microinjection capillary glass | World Precision Instruments, Inc. | TW120F-4 | Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | With platinum-iridium box filament (part # FB330B) |
| Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope | Nikon Instruments | 20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table | |
| Charge-coupled device (CCD) camera | Cohu Inc. | 6410 | |
| Video monitor | Sony Corporation | PVM-122 | Black and White, 9” screen |
| Micromanipulator system | Eppendorf | 5171 | |
| Microinjection Unit | Eppendorf | FemtoJet Express | |
| Microinjection controller | Contour Design | S-PROV2 | Programmable multimedia controller |
| Igor Pro | WaveMetrics | Version 4.05A | Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda |
References
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- Schofield, G. G., Ikeda, S. R. Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons. Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).
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