Summary
CDNA Doğrudan intranükleer enjeksiyonu, etkili bir post-mitotik hücrelerin transfeksiyon tekniktir. Bu yöntem, tek veya birden fazla cDNA yapıları heterolog protein ekspresyonu yüksek düzeyde sağlar ve tek bir hücre deneyleri çeşitli fizyolojik ilgili bir ortamda incelenmesi gereken protein fonksiyonu sağlar.
Abstract
Primer nöronal hücre kültürleri ölümsüzleştirdi hücre hatları ile karşılaştırıldığında daha fazla biyolojik ilgili sistem temsil ettiği protein fonksiyonu çalışma için değerli araçlar. Ancak, birincil nöronların post-mitotik doğa, elektroporasyon veya kimyasal aracılı transfeksiyon gibi ortak prosedürlerini kullanarak etkili heterolog protein ekspresyonunu engeller. Böylece, diğer tekniklerin etkili olmayan bu bölünen hücreleri proteinleri ifade etmek için istihdam edilmesi gerekmektedir.
Bu makalede, ayrışmış yetişkin sempatik nöronlar cDNA yapıları intranükleer enjeksiyonları gerçekleştirmek için gerekli adımları açıklar. Bu teknik, farklı tipte nöron uygulanmıştır başarıyla heterolog protein ekspresyonu neden olabilir. Mikroenjeksiyon işlemi için gerekli ekipman, hücreleri, N 2 (g) basınç dağıtım sistemi bağlı cDNA çözümü ile dolu bir cam enjeksiyon pipetlemeyin ve mikromanipülatör görselleştirmek için ters bir mikroskop içerir . Mikromanipülatör basınçlı N 2 pipetlemeyin ucundan cDNA çözüm çıkarmak için kısa bir darbe ile mikroenjeksiyon pipetlemeyin enjeksiyon hareketi koordine eder.
Bu teknik, diğer birçok transfeksiyon yöntemleri ile ilişkili toksisite ve tutarlı bir oranı ifade edilmesi, birden fazla DNA yapıları sağlar değildir. Enjekte edilen hücrelerin sayısının düşük olması gibi elektrofizyolojik kayıtlar ve optik görüntüleme gibi tek bir hücre çalışmaları için uygun mikroenjeksiyon işlemi yapar, ancak hücreleri ve yüksek transfeksiyon verimliliği daha çok sayıda gerektiren biyokimyasal deneyleri için ideal olmayabilir. Intranükleer microinjections ekipman ve zaman bir yatırım gerektirmesine rağmen, yeteneği fizyolojik ilgili çevre heterolog protein ekspresyonu yüksek düzeylerine ulaşmak amacıyla bu tekniğin proteinin fonksiyonunu araştırmak için çok yararlı bir araç yapar.
Protocol
I. enjeksiyon için hazırlanması
Bu bölümde cDNA nöron çekirdeği içine enjekte önce alınması gereken hazırlık adımları açıklar. Nöronlar için izolasyon prosedürü, bu makalenin kapsamı dışındadır, ancak, bireysel hücrelerine ayrı nöron var ve (bunu elde etmek için yararlı ipuçları için tartışma bakınız), 35 mm, hücre kültürü yemekleri alt yüzeyi iyice yapışmış önemlidir. Farklı nöronların çeşitli potansiyel olabilir rağmen rahatlıkla erişilebilir ve çok sayıda nöron verim, çünkü üstün servikal ganglion (SCG) veya dorsal kök gangliyon gibi periferik ganglionlar diseksiyonu için tercih edilir. SCG nöronlar kullanarak ek avantajlar hücrelerinin görece homojen bir nüfus olduğunu ve 1,2,3,4 iyi karakterize .
A. hazırlanması, enjeksiyon için cDNA plazmid
- Kontaminasyon veya DNA dökümünü önlemek için, hazırlanması sırasında eldiven giyilmelidir.
- Ilgi protein kodlayan DNA yapısal olarak aktif ve son derece sitomegalovirüs (CMV) organizatörü düzenleme altında PCI (Promega, Madison, WI) gibi uygun bir memeli ekspresyon vektörü, subcloned. Protein etiketli değilse, plazmid bir muhabir, örneğin kodlama EGFP (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), başarılı bir enjeksiyon ve ifade onaylamak için ortak enjekte edilir. DNA parçacık kaldırmak için bir PVDF filtresi (0.1 mikron, Millipore, Bedford, MA) ile santrifüj bir filtre ünitesi kullanarak yüksek kaliteli ayırma sütun (örneğin QIAfilter Midi-prep kiti, Qiagen, Chatsworth, CA) ve daha arıtılmış kullanılarak izole edilmiştir plazmid hazırlanması, enjeksiyon işlemi sırasında enjeksiyon pipetleri engelleyebilir. Plazmidler yaklaşık 1 mg / ml konsantrasyonda uygun bir DNA saklama tamponu (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0, örneğin TE tamponu) -20 ° C'de saklanır.
- Mikroenjeksiyon için hemen önce, plazmid cDNAs TE tampon ya da H 2 O. istenen nihai konsantrasyonu seyreltilir ve karıştırılır Tipik olarak, 5-10 ng / ul muhabir gen enjekte edilen hücrelerin etiketlemek için yeterli ve DNA yüksek konsantrasyonlarda az viskoz ve enjeksiyon pipetleri yapışmasına neden olabilir enjekte edilecek cDNA toplam konsantrasyonu 200 ng / ml geçmemelidir. Enjeksiyon için cDNA küçük hacimli (5-10 ul) Parafilm (kağıt desteğini altında yan) küçük bir parça temiz bir yüzey üzerine çözüm karıştırma damla tarafından hazırlanmıştır. Pipetor ile birkaç kez yukarı ve aşağı pipeting birlikte çözüm damla karıştırın ve karıştırma sırasında hava kabarcıkları almaktan kaçınması.
- Microloader pipetlemeyin ucu (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY) kullanarak, özel olarak hazırlanmış bir hematokrit tüpü (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) cDNA çözüm aktarın. Hematokrit tüpleri (Malzeme Tablo) hazırlanması ile ilgili talimatlar için malzemeler bölümüne bakın. Hematokrit tüpü, tüpe 1,5 ml mikrosantrifüj cDNA enjeksiyon solüsyonu içeren yerleştirin.
- Oda sıcaklığında (20-24 ° C) tortu parçacıklara cDNA çözüm blok olabilir, 15-30 dakika süreyle sabit bir açı ya da sallanan bir kova rotor (Eppendorf) ile donatılmış bir mikrosantrifüj 10 000 g tüp Santrifüj mikroenjeksiyon pipetlemeyin. CDNA enjeksiyon çözüm enjeksiyon oturumu sırasında, oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
B. Fabrikasyon enjeksiyon pipetleri
- Tek kullanımlık cam mikroenjeksiyon pipetleri kolay ancak pahalı (mikroenjeksiyon pipetlemeyin başına 10 $), (Femtotips örneğin, Eppendorf) piyasada mevcuttur. Enjeksiyon pipetleri programlanabilir P-97 Brown pipetlemeyin çektirmenin Flaming (Sutter Instrument Company, Novato, CA) ve filamented, ince duvarlı borosilikat camdan kılcal tüpler (Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL) kullanarak laboratuvarda imal edilebilir. Bu seçenek, daha maliyet-etkin ve mikroenjeksiyon pipetlemeyin şekil ve boyut kontrolü sağlar.
- Iki aşamalı bir program dar mikroenjeksiyon pipetlemeyin ipuçları çekmek için kullanılır. Mikroenjeksiyon pipetleri açılışında bir ışık mikroskop altında incelemek için çok dar olduğundan, enjeksiyon pipetleri kalitesini program ayarları kesinleşir önce birkaç hücre enjekte edilerek doğrudan değerlendirmek gerekmektedir. Aşağıda, ısı, çekme, hız ve zaman ayarları için yaklaşık ayarlar şunlardır: (çekme 1) 600, 115, 15, 250; (çekme 2) 640, 130, 65, 200. Bu ayarlar farklı toplu cam ve ısıtma filament çektirmenin durumu değişir ve gerektiği şekilde ayarlanması gerekir. Daha fazla ayrıntı için 5'e bakınız.
- Enjeksiyon oturumu sırasında hasar veya sorunlar durumunda, enjekte edilecek, nöron çanak başına birkaç (2-5) enjeksiyon pipetleri çekin. Mağaza enjeksiyon, toz mikroenjeksiyon pipetlemeyin ucu girmesini önlemek için kapalı bir kapta pipetleri.
II. Intranükleer mikroenjeksiyon
çadır "> Bu bölümde ayrıntıları cDNA nöron çekirdek içine enjekte sürecinin temel bir mikroenjeksiyon set-up işlemini görselleştirmek için bir ters faz-kontrast mikroskobu (örneğin Nikon Diaphot TMD, Nikon, Melville, NY), mikromanipülatör (örn. pipetlemeyin cDNA çözüm sınırdışı enjeksiyon pipetlemeyin hareket ve enjektör (örneğin Eppendorf FemtoJet Express) bir basınç kontrol etmek için Eppendorf 5171). mikromanipülatör basıncı enjektör bağlanması enjeksiyonlar sırasında son iki süreçlerin senkronizasyon sağlar. isteğe bağlı, ancak şiddetle tavsiye bağlanmış bir video izleme sistemi (CCD kamera, Cohu Inc, San Diego, CA, siyah ve beyaz video monitör, Sony Corporation, Tokyo, Japonya), bileşenler içerir. Bu sistem, enjeksiyon için mutlak bir gereklilik değildir; Ancak, siyah ve beyaz monitör, hücre çekirdeğinin gelişmiş görselleştirme için yüksek kontrast sunar ve uzun enjeksiyon oturumları sırasında daha rahat bir izleme deneyimi sunuyor. Buna ek olarak, elde tutulan bir kontrol ünitesi çalışması için yazılımı çalıştıran bir dizüstü bilgisayar yarı-yararlanılabilir (Detaylar için tartışılması bakınız) enjeksiyon işlemi otomatikleştirmek.SCG nöronlar enjekte etmek için ideal zaman 3-6 saat sonrası disosiasyon. Bu aşamada, hücreleri yemeğin altına sıkıca bağlı ve çekirdeği, tek veya birden çok nükleol (Şekil içeren karanlık bir membran ile merkezi bir yuvarlak organel olarak, faz-kontrast mikroskop altında, açıkça görülebilir, küresel 1A).
- Ayrışmış nöronlar mikroskop sahne ortasına bir tabak koyun. Odağı ayarlayın ve faz kontrast mikroskop optik optimize nöronların çekirdekleri açıkça görülebilir.
- Microloader pipetlemeyin ucu kullanarak mikroenjeksiyon pipetlemeyin içine hazırlanmış cDNA çözüm pipetleyin 2 ul. Bu santrifüj sırasında yerleşen parçacık kadar karıştırın beri hematokrit tüpünün alt kısmına yakın çözüm çizim kaçının. Mikroenjeksiyon pipetleri filament ucu çözüm çizim yardım, ancak küçük hava kabarcıkları devam ederse, onları hafifçe çıkarmak için cam yan fiske olmalıdır.
- Kapiller basıncı enjektör tutucu içine mikroenjeksiyon pipetlemeyin takın ve ardından mikromanipülatör sahibinin güvenli. 45 ° açıyla sahibinin sabittir.
- Çanak içine mikroenjeksiyon pipetlemeyin indirin. Pipetlemeyin kültür ortamı girerken, menisküs ışığın kırılma etkiler ve nöronlar görüntü kalitesini düşürür oluşur. Bu sorunu hafifletmek için, nöronların çekirdekleri daha net bir şekilde görülebiliyor kadar faz halka taret biraz mahsup edilebilir.
- Bazı basınçlı enjeksiyon sistemleri, kısa bir süre için mikroenjeksiyon pipetlemeyin ucundan maksimum hava basıncı uygulayan bir "temiz" fonksiyonu var. Ucu tıkanmış görünüyor başlamadan önce ve enjeksiyon sırasında enkaz pipetlemeyin temizlemek için bu işlevi kullanın. Bu işlevi kullanırken effect sıvı ekranda görünmüyorsa, yeni bir enjeksiyon pipetlemeyin ile değiştirin.
- Merkezi mikroenjeksiyon görüntüleme monitör pipetlemeyin ve nöron bir yanında ve nükleolus aynı odak düzlemli ucu hizalamak. Bu pozisyonda mikromanipülatör z-ekseni alt limit olarak ayarlayın. Bu pozisyon, mikroenjeksiyon pipetlemeyin enjeksiyonlar sırasında önceden derinliği. Şimdi bu noktada üzerinde yaklaşık 30 mikron ucu mikroenjeksiyon pipetlemeyin nöron üst temizler böylece yerleştirin.
- Intranükleer enjeksiyonları gerçekleştirmek için aşağıdaki ayarları ile tanımlanan bir Eppendorf 5171 mikromanipülatör "enjekte" modunda olabilir. Enjekte fonksiyonu ayarlandığında, Impale fonksiyonu kapalı iken. Çapraz enjeksiyon yolu (x-ve z-ekseni boyunca) hücre hasarı en az üretir ve böylece eksenel mod enjeksiyonlar için kullanılmalıdır. 300 mm / sn 'lik bir enjeksiyon hızı yeterli ve mikroenjeksiyon pipetlemeyin z-ekseni sınırı set ulaştığında basınç birikmesini senkronize.
- Basıncı enjektör çekirdeğin içine enjekte cDNA çözüm miktarını kontrol eder. "Otomatik" enjeksiyon modunda, DNA teslim süresi kontrollü ve bağlı mikromanipülatör tarafından başlatılan. Enjeksiyon basıncı (Pi) 100 ila 200 hectopascals (1 inç ~ 0.015 psi hPa) arasında ayarlanabilir olmalıdır yüksek enjeksiyon basınçları enjeksiyon başarı oranları veya kalitesini artırmak ve mikroenjeksiyon pipetlemeyin ucu boyutu veya DNA saflık diğer sorunlara işaret edebilir . Bir enjeksiyon süresi 0.3 sn (ti) ve 30 hPa, parçacıklar kapatılmasıy kültür ortamı pipetlemeyin ucu içine girişini önlemek için sabit bir pozitif basınç sağlayan bir tazminat basıncı (Adet) kullanılmalıdır.
- Mikroenjeksiyon pipetlemeyin ucu xy eksen sahne kumanda kullanılarak mikroskop altında enjekte edilir nöron yerleştirin. T arasında ileri ve geri odaklanarak, merkezi çekirdeğin yukarıdaki pipetlemeyin ucu hizalayıno ucu ve nükleol.
- Enjekte düğmesine (mikromanipülatör) basarak çekirdeği enjekte edilir. Enjeksiyon adım için, mikroenjeksiyon pipetlemeyin ve cDNA çözümün serbest hareket mikromanipülatör tarafından kontrol edilir. Göz başarılı intranükleer enjeksiyonları onaylamak için zordur, fakat nispeten düşük viskoziteli cDNA çözüm enjeksiyon (viskoz nükleer çevreye göre), genellikle faz-kontrast optik altında beyaz bir tüy gibi görünür ve enjeksiyon bir göstergesi olarak kullanılabilir çekirdeğin içine. Bazen mikroenjeksiyon pipetlemeyin nükleer membran nüfuz değildir ve sadece çekirdeğin titreşim. Aynı pozisyonda ikinci bir enjeksiyon denemesinde başarılı bir enjeksiyon çekirdeğin içine DNA yol açabilir. Hücre şişmesi genellikle kasıtsız sitoplazmik enjeksiyon göstergesidir. Ayrıca, önemli bir nükleer şişme nöronların hücre ölümü ve genellikle sonuçları kısa bir süre sonra tolere değildir, bu yüzden enjeksiyon basıncı ve süresi önerilen değerleri aşmamalıdır.
- Mikroenjeksiyon pipetlemeyin altında bir sonraki nörona hizalamak için mikroskop aşamasında yeniden nöronlar enjekte devam edin. Sistematik, tabak nöron gece inkübasyon için inkübatör dönmeden önce yaklaşık 50-100 çekirdekleri enjekte çanak gezinmek. Başarıyla enjekte nöronlar muhabiri gen ekspresyonu tarafından ertesi gün tespit edilebilir.
III. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1: Superior servikal ganglion (SCG) nöronlar.
Faz kontrastlı görüntü nöronlar SCG 3 saat sonrası disosiasyon (A). Bu aşamada, mikroenjeksiyon pipetlemeyin ucu uyumuna yardımcı olan çekirdeğin açıkça görülebilir. Çekirdeği, bir tek (sol) veya birden fazla (sağda) karanlık nükleol nöron merkezinde görünür.
Çekirdeği (B) cDNA EGFP enjeksiyonu takiben 16 saat SCG nöronlar. Sol, faz-kontrast aydınlatma altında görüntülenen nöronlar SCG. Sağ, başarılı bir enjeksiyon gösteren ve bir nöron EGFP ifade sonuçlanan aynı nöron epifluorescent görüntü.
Beyaz ölçek çubuğu 20 mm.
Şekil 2: aracılığıyla akımların Tüm hücre kayıtları heterologously ifade G-protein, K + (GIRK) kanalları içsel nöronlar SCG giderilmesi birleştiğinde .
GIRK akımları (I GIRK) -140 bir holding potansiyeli -60 mV 40 mV 200 ms gerilim rampası (A İçerlek) endojen α 2-adrenerjik norepinefrin tarafından aşağıdaki aktivasyon (KD, 10 mcM) tarafından uyarılmış . Süperempoze izleri önce (siyah) ve KD tek başına (mavi) veya NE uygulama artı 10 mM Ba 2 + (kırmızı) sonra aynı nöron kayıtları ve gösterir. Kesikli çizgiler sıfır akım düzeyini gösterir.
Ben GIRK, harici bir çözüm (mM) 130 NaCl, 5.4 KCl, 10 Hepes, 10 CaCl 2, 0.8 MgCl 2, 15 glikoz, sakkaroz, 15 ve 0.0003 TTX NaOH ile pH 7.4 'e ayarlanmış kayıt için . Dahili kayıt çözümü (mM) 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 Hepes, 4 MgATP, ve KOH ile pH 7.2 'ye ayarlanır 0,3 Na 2 GTP, içeriyordu.
(A) akım eksikliği KD uninjected SCG nöronların varlığını gerilim rampası tarafından ortaya. Gösterir, bu SCG nöronların endojen GIRK kanalları ifade yoktur. Başarılı enjeksiyon plazmid cDNA kodlama fonksiyonel bir GIRK kanal 11 KD (B, sol) maruz kaldığında gerilim rampası sırasında büyük akımlara yol açmaktadır. : G-protein kenetli reseptör agonist (NE), içe düzeltme ve varsayılan GIRK kanal blokeri, Ba 2 + (B, sağ kırmızı iz) akımları blok tarafından aktive Akımlar GIRK kanallar aracılığıyla akımların tipik özellikler var. Açık ve dolu çevreler sırasıyla, holding ve pik akım GIRK temsil eder. Lütfen Şekil 2'de büyük halini görmek için buraya tıklayın .
Discussion
Karşılaşılan ortak sorunları ve önerileri:
Daha önce belirtildiği gibi, başarılı bir nükleer enjeksiyonlar doku kültürü plakaları yapışık hücrelere sahip bağlıdır. Enjeksiyon başlangıç ertelemek hücre disosiasyon prosedürü izleyerek bir kaç saat nöronlar yemekleri alt yapışmasına yol açar. Buna ek olarak, 0.1 mg / ml 'lik yüksek molekül ağırlıklı poli-L-lisin (Sigma, St Louis, MO) yemekleri alt yüzeye nöronların yardımcıları yapışma kaplama yemekler.
Yüksek konsantrasyonda DNA enjekte etmeye çalışırken özellikle mikroenjeksiyon pipetleri tıkanması, sık görülen bir sorun olabilir. Plazmid DNA izole etmek ve arındırmak için yüksek kaliteli ayırma kolonları kullanarak ve (spin filtreler, hematokrit tüpler iplik) belirtilen ek saflaştırma adımları gerçekleştirmeden önce enjekte parçacık kaldırmak için yardımcı olabilir. Enjeksiyonlar sırasında, basınç enjektör "temiz" fonksiyonu (0.2 s için yeterli) olabilir, ancak bu sorunu çözmezse, yeni bir enjeksiyon pipetlemeyin kullanılmalıdır. Mikroenjeksiyon pipetleri çoğunluğu bir enjeksiyon oturumu sırasında tıkanmış hale gelirse, daha büyük bir açılış ile mikroenjeksiyon pipetlemeyin ipuçları üretmek için damlalıklı cam çektirmenin ayarlarını değiştirerek düşünün.
Nükleer enjeksiyonlar sırasında ortaya çıkan diğer bir konu, doku kültürü yemekleri alt yüzeyi eşitsizliği. Bu değişkenliği doğrudan derinlik beri enjeksiyonlar sırasında pipetlemeyin traversler sabit çekirdeğine enjeksiyon pipetlemeyin ipuçları hedefleme doğruluğunu etkiler. Bu nedenle, bu z-ekseni sınırı, aynı tabak içinde enjeksiyonların seyri sırasında ayarlanması gerekir. Bir ayarlama gerekli olduğunda belirgin olacaktır: (nükleer enjeksiyon (çekirdeği veya hücre tamamen cevapsız hiçbir beyaz tüy) dair hiçbir işaret yok, ya da enjeksiyon pipetlemeyin ucu çanak alt gelir hücre sıkıştırarak hatta) pipetlemeyin ucu çanağın dibine çöküyor. Cam klonlama silindir (OD 10 mm, Kedi No 2.090-01.010, Bellco Cam, Vineland, NJ) nöronların kaplama sırasında daha küçük, daha dar bir alanda onları kısıtlamak için kullanılan olabilir, bu nedenle hareket ettirmek için gerekli mesafeyi en aza indirmek enjeksiyonlar arasındaki enjeksiyon pipetlemeyin. Bu klonlama silindir microinjections performans önce kaldırılır.
Teknik Dezavantajları:
Intranükleer microinjections teknik sabır ve yüksek derecede bir operatör tarafından el becerisi gerektiren talep ediyorlar. Bu tekniği ile Yeterlik, başka bir beceri ile gibi, uygulama ile geliyor. Bu nedenle, gerçek deneyler denemeden önce muhabiri genin tek başına nükleer enjeksiyon uygulama tavsiye edilir. Daha fazla enjeksiyon işlemi yardımcı olmak için, bir bilgisayar programı ve basıncı enjektör içine mikromanipülatör adımları sağlamlaştırmak için mümkün olabilir. Igor Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, OR) gibi programlar (mikroenjeksiyon ayarları saklamak için 6,7,8 görmek ve yarı otomatikleştirmek enjeksiyon işlemi için programı çok fonksiyonlu denetleyicileri (ShuttlePro, Çevre Tasarım, Windham, NH) kullanılmalıdır. bakın).
Intranükleer mikroenjeksiyon tekniği Bir diğer dezavantajı ise düşük başarı oranı. Teşebbüs nükleer enjeksiyonlar yaklaşık% 10-20 protein ifade neden olur. Bu etkinliği çok sayıda ifade hücreler, örneğin elektrofizyoloji, çeşitli biyokimyasal testleri için bu yeterli olmayabilir gerekmez uygulamaları için yeterli olabilir rağmen.
Teknik Uygulamalar:
Sakıncaları olmasına rağmen, DNA intranükleer mikroenjeksiyon heterologously nöronların proteinleri ifade etmek için son derece yararlı bir tekniktir.
Yüksek düzeyde protein ekspresyonu, çünkü çekirdeğin enjeksiyonları, düzenleyen bir gen transkripsiyonu ve çekirdeğinde bulunan plazmid uzun istikrar son derece aktif CMV organizatörü sırasında salınan plazmid çok sayıda nükleer microinjections ile elde edilir. Protein-ifadesi üzerine heterolog proteinlerin yüksek düzeyde endojen protein istila etmek için gerekli olan dominant-negatif deneylerde özellikle yararlıdır. Intranükleer enjeksiyonları diğer bir avantajı çok yapıları enjekte edilir çekirdeğine cDNA yapıları tutarlı bir kısmı teslim yeteneğidir. Diğer transfeksiyon yöntemleri ile, her DNA aynı oranda tekrarlanabilir aynı çanağı içinde ve transfections arasında farklı hücrelerin içine inşa tanıtmak için zordur. Çekirdeğin içine cDNA çözüm Direkt enjeksiyonlu değişkenlik bu kaynağı ortadan kaldırır ve ifade proteinlerin oranının etkin bir şekilde titre olanak sağlar.
Geleneksel transfeksiyon yöntemleri post-mitotik hücrelerin içine DNA transfeksiyon REAG ile ilişkili 9 çekirdeği ve kimyasal toksisitesi düşük esas nedeniyle sınırlı etkinliğiveliler 10. Nükleer microinjections çekirdeğindeki genetik materyalin içine mekanik getirerek bu sorunların üstesinden gelmek. Bu tekniği daha fazla dahil olmasına rağmen, fonksiyonel bir biyolojik sistem bir proteinin etkisini araştırmak için yeteneği, bu tekniğin zahmetli doğa dengeler daha fazla endojen sinyal yolları tamamlamak.
Tüm hayvanlar üzerinde deney prosedürleri göre, Ulusal Sağlık Hayvan Bakım ve Kullanım Kuralları Enstitüleri ile yapıldı.
Acknowledgments
Bizim laboratuar araştırmaları NIH İntramural Araştırma Programı, Ulusal Alkol İstismarı ve Alkolizm Enstitüsü tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultrafree-MC Filter Unit | EMD Millipore | UFC30VV00 | Durapore PVDF filter; 0.1 μm pore-size |
| TE buffer | Quality Biological, Inc. | 351-010-131 | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0 |
| Micro-hematocrit capillary tubes | Fisher Scientific | 22-362-574 | Unheparinized Preparation: Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95°C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417 R | With a fixed angle or swinging-bucket rotor |
| Microloader 20 μl pipet tips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Microinjection capillary glass | World Precision Instruments, Inc. | TW120F-4 | Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | With platinum-iridium box filament (part # FB330B) |
| Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope | Nikon Instruments | 20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table | |
| Charge-coupled device (CCD) camera | Cohu Inc. | 6410 | |
| Video monitor | Sony Corporation | PVM-122 | Black and White, 9” screen |
| Micromanipulator system | Eppendorf | 5171 | |
| Microinjection Unit | Eppendorf | FemtoJet Express | |
| Microinjection controller | Contour Design | S-PROV2 | Programmable multimedia controller |
| Igor Pro | WaveMetrics | Version 4.05A | Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda |
References
- Eccles, J. C. The action potential of the superior cervical ganglion. J Physiol. 85, 179-206 (1935).
- Ikeda, S. R. Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein βγ subunits. Nature. 380, 255-258 (1996).
- Schofield, G. G., Ikeda, S. R. Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons. Brain Res. 485, 205-214 (1989).
- Schofield, G. G., Ikeda, S. R. Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons. Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).
- Dean, D. A. Chapter 4. Live Cell Imaging: a Laboratory Manual. Goldman, R. D., Spector, D. L. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 51-66 (2005).
- Ikeda, S. R. Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection. Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).
- Ikeda, S. R. Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection. Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).
- Ikeda, S. R., Jeong, S. W. Use of RGS-insensitive Gα subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons. Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30, 606-610 (2008).
- Vivaudou, M. Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants. J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).
