Summary
この記事では、光退色後の多光子蛍光の回復を使用して拡散係数を測定するための手順を説明します。我々は、サンプルへの光路に沿ってレーザーを合わせ、適切な実験パラメータを決定することによって開始されます、その後の生成を続行し、最終的にフィッティング蛍光回復曲線。
Abstract
光退色後のマルチ蛍光回復は、高分子の拡散係数を（または類似のトランスポートパラメータ）を測定するために使用する顕微鏡技術である、との両方に適用することができます。
Protocol
1。光学系の位置を合わせます。
MP - FRAP実験のための重要な設備は、次のとおりです。モード同期レーザ光源、ポッケルスセル（光変調用）、パルスジェネレータ、ダイクロイック、対物レンズ、蛍光発光フィルター、ゲート光電子増倍管、およびデータ記録システム（光子計数器をとマルチチャンネルスケーラ）。
2。安全モニターの電源を決定します。
- サンプル内で蛍光を生成するための、低い、しかし合理的なパワーにレーザーを減衰させる。
- サンプル内にフォーカス。
- はるかに長い予想される蛍光の回復よりも時間スケールを介して統合するフォトンカウンタを設定します。焦点体積が試料内の固定された（私達の顕微鏡のソフトウェアでこれはポイントスキャンによって達成される）と、フォトンカウントデータの合理的な数を記録。
- 電力を増加させると光子のカウントデータの別のシリーズを取る。フォトンカウントの増加が電力の増加を基準にして大幅に減少すると表示されるまで繰り返します。
- ログ（電力）の関数としてプロットログ（光子計数）。二つの傾きからの偏差は、モニター中に漂白示します。お使いのモニタの電源として、以下のこのカットオフですが、これはノイズ比に対する合理的な信号を可能にする電源を選択してください。
3。パルス発生器とマルチチャンネルスケーラに入力パラメータを決定する。
- 拡散係数と回復時間の文献に基づいて、及び/またはStokes - Einsteinの方程式および拡散方程式の一般向けのエンベロープの推定値を決定する。
- パルス発生器とスケーラ上で必要なパラメータ値を設定します。
- パルスジェネレータでは、事前に漂白剤や漂白剤回数を設定します。経験則の良いセットは、事前に漂白剤が予想される半分の回復時間に比べ1-2倍大きくなるはず、と漂白時間は十分の一、期待半分の回復時間でなければならないということです。
- スケーラーで、約半分漂白剤の持続時間にビンの幅を設定し、記録ごとのビンの数を設定して、選択されたビンの幅と、レコードごとのビンの製品がより大きいか、予想される完全な回復に加えて、事前にほぼ等しくなるように - 漂白剤や漂白剤の回。
- パルス発生器に戻ると、ビンの幅の倍の製品レコードあたりのビンの数の逆数よりちょうど小さい値に等しいpre-bleach/bleach/monitorシーケンスの頻度を設定します。 *
- 最後に、レコード数を設定/選択したモニターの電源での信号強度に基づいて、スケーラーにスキャン。
*これは、パルス発生器で設定した完全なpre-bleach/bleach/monitorシーケンス（1/frequency）のための時間は、スケーラに設定されたデータ収集時間（ビン幅×ビン/記録）を超えていることを非常に重要です。この基準が満たされていない場合は、複数の漂白剤のトリガーは、スケーラの単一のレコード内に表示されることがあります。
- 以前に決定された許容レベルにモニターの電源を設定します。モニター漂白テスト中に決定される漂白カット上記で200mW程度に漂白剤のパワーを設定します。これらの力は、PCの結晶間の異なる電圧などのセットの両方があります。
- 顕微鏡をシール、ライトを遮断し、PMTをオンにして、パルスジェネレータとスケーラを開始する、顕微鏡のソフトウェア上のポイントのスキャンを開始します。
- 1）事前に漂白剤蛍光、2）蛍光直後の漂白剤、およびデータセットの最後に3）蛍光：曲線をプロットし、3つの重要なポイントをマークすることで、その結果回復曲線を分析する。蛍光値を使用して前と直後の漂白剤よりハーフリカバリ時間を推定する。
- ハーフ回復時間のこの見積もりで、新しいプレ漂白剤、漂白剤の値、およびビンの幅の期間を決定する前に概説した親指のルールを使用してください。また、より完全な回復を達成するために必要な時間を見積もるために、データセットの最後にプリ漂白剤蛍光と蛍光を使用してください。経験則として、データはデータの後半のために報告されるように完全な回復を可能にする期間のために収集する必要があります。
- あなたのカーブが強い漂白剤とスムーズな回復を示すまで、パルスジェネレータとスケーラ上でパラメータを調整、パラメータを新しいカーブを取り、調整を続ける。可能であれば、漂白剤の持続時間ができることに留意してください、そして、親指のルールの下に小さくする必要があります。浅すぎる、または深すぎる、漂白剤が達成されている場合は漂白剤のパワーをも調整することができます。
4。励起の飽和のためのテスト。
- 以前に決定された適切なモニターと漂白剤の力を、使用して、MP - FRAP曲線の一連を取る。適切な数学的形態と非線形最小二乗フィッティングアルゴリズム（以下、"データ解析"を参照）を使用して、事前に漂白剤蛍光に対して正規化各回復を、分析する。漂白剤の深さのパラメータの近似値を記録します。
- 漂白剤のパワーの値を増加させることMP - FRAPカーブの連続するシリーズを取り、分析を続行。
- ログ（電力）の関数としてプロットログ（漂白剤の深さのパラメータ）。二つの斜面から逸脱すると、励起の飽和を示している。強力な漂白剤が得られるが、飽和が発生しない漂白パワーを選択してください。
5。 MP - FRAP曲線の服用を続け。
- 上記のように、すべてのパラメータが正しく設定される、曲線の服用を続け。
6。データ解析。
- 蛍光データから事前に漂白剤や漂白剤、データなど時間のデータを設定し、調整を取り外しますその直後の漂白剤蛍光値はt = 0に対応。
- 平均的なプレ漂白剤蛍光に関して生じる蛍光の回復を正規化する。
- 適切な数学モデルやMATLABなどのlsqcurvefitは関数として非線形、最小二乗フィッティングアルゴリズムを使用して、正規化曲線をフィット。ここで紹介するモデルは、拡散と対流の影響を受けて蛍光回復を占めている。
F oは事前に漂白剤の平均蛍光ここで、βは、漂白剤の深さのパラメータである、τDは特徴的な拡散性の回復時間は、Rは半径方向（W R）幅の軸方向の二乗の比率（w Z）です。二光子焦点ボリューム、τVX = W R / V X、τVY = W R / V Y、τVZ = W のz / V Z、およびV 2 = V × 2 + V Y 2 + V Z 2である対流の速度。結像面に限局フローの場合、τVZ→∞と1 /τVX + 1 /τVYは、1 /τVRに置き換えることができます。対流がない場合には、分子の両方の指数が1に移動し、式が大幅にのみ2つのフィッティングパラメータ、β、τ、Dに、低減されます。拡散係数は、簡単にD = W R 2 /8τDとして計算されます。
7。代表的な結果。
図1代表的な漂白剤とFITC - BSAのための回復曲線。良好な回復曲線は、データの後半のために報告されている完全な回復での蛍光で、強力な漂白剤とスムーズな回復を示す。
図2。FITC - BSA（赤）と関連付けられている最小二乗フィット（黒）のための正規化された回復曲線。このフィットは、文献と一致52.9 UM2 / sの拡散係数を、もたらします。
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Discussion
光退色後の多光子蛍光回復の力は、3次元分解能で厚さのサンプルを調査する能力にあります。 1990年代の開発以来、MP - FRAPは細胞体、 生体外で厚い組織切片、 および in vivo組織と間質への拡散係数を（または類似のトランスポートパラメータ）を決定するために使用されています。この記事では、MP - FRAP実験、ならびに、実験パラメータの設定データを取得し、回復曲線を分析する、ビームのパスを整列させるための適切な手順を実行するために必要な機器を発表した。
適切な励起波長と発光フィルターの選択肢は2つの光子断面積と放射スペクトルによって導かれるべきである。この情報は頻繁に様々な染料のための技術データに含まれています。また、レーザービームの位置合わせで、それは客観のバックレンズの適切な過剰充填を達成することが重要です。これは、多くの場合、光学系にビームエキスパンダーを追加することによって実現されます。適切な過剰充填は、軸方向および半径方向の両方で、サブ解像度固定蛍光ビーズをスキャンして、プロットと文献値との比較のために1 / e 2の幅を見つけるためにガウス分布する蛍光のプロファイルをフィッティングすることにより確認することができます。
適切な監視と漂白力を選択することも重要です。監視に使用される電力蛍光プリポスト漂白剤は、良好な信号対雑音比を可能にするために十分に高い漂白かなり発生しないように十分に低くなるはずです。漂白パワーは励起の飽和を回避する必要があります。 MP - FRAP実験では試料上の入射パワーの二乗に比例する蛍光励起率、には上限があります。この制限は、励起の飽和領域の開始をマークします。励起飽和領域で動作して漂白剤の力を使って生成した蛍光回復曲線は、誤って低い拡散係数が得られます。
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Acknowledgments
この作業はホープScholarの賞の防衛時代の部（第W81XWH - 05から0396まで）とエドワードB.ブラウンIIIに医歯薬学総合研究賞のPewの学者によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ti:sapphire laser | Newport Corp. | Mai Tai | |
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | |
| Laser Scanning Microscope | Olympus Corporation | Fluoview | |
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 670 DCSX-2P | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | |
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | |
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | |
| FITC-BSA | Invitrogen | -- |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. rown, Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
