Summary
इस अनुच्छेद में हम प्रसार बहु photon प्रतिदीप्ति वसूली के बाद photobleaching का उपयोग गुणांकों को मापने के लिए प्रक्रिया का वर्णन करेंगे. हम नमूना करने के लिए ऑप्टिकल पथ के साथ लेजर aligning और उचित प्रयोगात्मक मापदंडों का निर्धारण शुरू हो जाएगा, तब पैदा जारी रखने और अंत में फिटिंग प्रतिदीप्ति वसूली घटता.
Abstract
Photobleaching के बाद मल्टी प्रतिदीप्ति वसूली एक माइक्रोस्कोपी तकनीक अणुओं की प्रसार गुणांक (या अनुरूप परिवहन पैरामीटर) को मापने के लिए इस्तेमाल किया है, और दोनों के लिए लागू किया जा सकता है
Protocol
1. प्रकाशिकी संरेखित करें.
एक सांसद FRAP प्रयोग के लिए प्रमुख उपकरण शामिल हैं एक मोड बंद लेजर स्रोत, Pockels सेल (बीम मॉडुलन के लिए), पल्स जनरेटर, dichroic, उद्देश्य लेंस, प्रतिदीप्ति उत्सर्जन फिल्टर, gated photomultiplier ट्यूब, और एक डेटा रिकॉर्डिंग प्रणाली (फोटान काउंटर: और scaler multichannel).
2. सुरक्षित मॉनिटर शक्तियों का निर्धारण करते हैं.
- नमूना भीतर प्रतिदीप्ति पैदा करने के लिए एक कम है, लेकिन उचित बिजली, लेजर attenuate.
- नमूना भीतर ध्यान दें.
- एक फोटान काउंटर सेट करने के लिए एक समय के पैमाने पर ज्यादा उम्मीद प्रतिदीप्ति वसूली की तुलना में एकीकृत. फोकल मात्रा नमूना भीतर स्थिर आयोजित (हमारे खुर्दबीन सॉफ्टवेयर पर यह एक बिंदु स्कैन के द्वारा हासिल की है), फोटोन गिनती के डेटा का एक उचित संख्या में रिकॉर्ड.
- शक्ति बढ़ाएँ और फोटॉन गिनती के डेटा का एक और श्रृंखला ले. दोहराएँ जब तक फोटोन गिनती में वृद्धि करने के लिए शक्ति में वृद्धि करने के लिए सम्मान के साथ काफी कम दिखाई देता है.
- लॉग (बिजली) के एक समारोह के रूप में प्लॉट लॉग (फोटॉन मायने रखता है). दो में से एक ढलान से एक विचलन मॉनिटर दौरान विरंजन इंगित करता है. आपके मॉनिटर शक्ति के रूप में एक शक्ति है कि इस कटौती के नीचे बंद चुनें, लेकिन जो शोर अनुपात करने के लिए एक उचित संकेत के लिए अनुमति देता है.
3. पल्स जनरेटर और multichannel scaler इनपुट पैरामीटर्स निर्धारित करते हैं.
- निर्धारित वापस लिफाफा प्रसार गुणांक और वसूली समय और साहित्य या समीकरण स्टोक्स आइंस्टीन / और प्रसार के समीकरण पर आधारित अनुमान है.
- पल्स जनरेटर और scaler पर आवश्यक पैरामीटर मान सेट करें.
- पल्स जनरेटर पर, पूर्व ब्लीच और ब्लीच बार सेट. अंगूठे के नियमों का एक अच्छा सेट है कि पूर्व ब्लीच 1-2 बार उम्मीद आधा वसूली समय से बड़ा होना चाहिए, और ब्लीच समय एक दसवें उम्मीद आधा वसूली समय किया जाना चाहिए.
- Scaler पर, लगभग एक आधा ब्लीच अवधि बिन चौड़ाई सेट, और रिकार्ड के अनुसार डिब्बे की संख्या सेट ऐसी है कि आपके चयनित बिन चौड़ाई और डिब्बे के रिकार्ड के अनुसार उत्पाद से अधिक या लगभग अपनी उम्मीद पूरी वसूली के अलावा पूर्व के बराबर है ब्लीच और ब्लीच बार.
- पल्स जनरेटर पर लौटें और pre-bleach/bleach/monitor एक बस बिन चौड़ाई बार रिकॉर्ड प्रति डिब्बे की संख्या के उत्पाद के व्युत्क्रम की तुलना में छोटे मूल्य के बराबर अनुक्रम की आवृत्ति सेट. *
- अंत में, रिकॉर्ड की संख्या सेट / अपने चुने हुए मॉनिटर सत्ता में संकेत तीव्रता के आधार पर scaler पर स्कैन.
* यह बहुत महत्वपूर्ण है कि एक पूरा pre-bleach/bleach/monitor (1/frequency) अनुक्रम पल्स जनरेटर सेट के लिए समय डेटा संग्रह (बिन चौड़ाई एक्स डिब्बे / रिकार्ड) scaler पर निर्धारित से अधिक है. यदि इस मापदंड नहीं मिले है, कई ब्लीच चलाता scaler पर एक एकल रिकॉर्ड के भीतर प्रकट हो सकता है.
- एक स्वीकार्य स्तर है, पहले से निर्धारित करने के लिए शक्ति मॉनिटर सेट. विरंजन मॉनिटर विरंजन परीक्षण के दौरान निर्धारित cutoff से ऊपर 200 मेगावाट या तो ब्लीच सत्ता सेट करें. इन शक्तियों पीसी क्रिस्टल भर में विभिन्न voltages के रूप में दोनों सेट कर रहे हैं.
- खुर्दबीन सील, बत्ती बंद, PMT पर बारी, खुर्दबीन सॉफ्टवेयर पर एक बिंदु स्कैन शुरू, तो पल्स जनरेटर और scaler शुरू करते हैं.
- विश्लेषण: 1) पूर्व ब्लीच प्रतिदीप्ति, 2) प्रतिदीप्ति तुरंत ब्लीच पोस्ट, और 3) डेटा सेट के अंत में प्रतिदीप्ति परिणामस्वरूप वक्र साजिश रचने और तीन महत्वपूर्ण अंक अंकन द्वारा वसूली वक्र. प्रतिदीप्ति पूर्व और तुरंत पोस्ट - ब्लीच करने के लिए बेहतर आधा वसूली समय का अनुमान है. मूल्यों का उपयोग करें
- आधा वसूली समय के इस अनुमान के साथ, अंगूठे का नियम पहले से उल्लिखित पूर्व ब्लीच ब्लीच, के लिए नए मूल्यों को निर्धारित करने के लिए, और बिन चौड़ाई durations का उपयोग करें. इसके अलावा, डेटा सेट के अंत में पूर्व ब्लीच प्रतिदीप्ति और प्रतिदीप्ति का उपयोग करने के लिए बेहतर समय पूरी वसूली प्राप्त करने की आवश्यकता का अनुमान है. अंगूठे का एक नियम के रूप में, डेटा है कि पूरा करने के लिए वसूली डेटा के उत्तरार्द्ध के लिए सूचित किया के लिए अनुमति देता है एक समय अवधि के लिए एकत्र होना चाहिए.
- पल्स जनरेटर और scaler पर पैरामीटर समायोजित करने के लिए, एक नया वक्र ले, और tweaking जारी मापदंडों जब तक अपने वक्र एक मजबूत ब्लीच और चिकनी वसूली दर्शाती है. ब्लीच अवधि कर सकते हैं कि मन में रखो, और अंगूठे के नियम के नीचे कम किया जाना चाहिए, यदि संभव हो तो. ब्लीच शक्ति भी अगर भी उथले है, या भी गहरी, ब्लीच हासिल है समायोजित किया जा सकता है.
4. उत्तेजना संतृप्ति के लिए टेस्ट.
- उपयुक्त मॉनिटर और ब्लीच शक्तियों, पहले से निर्धारित का उपयोग, सांसद - FRAP घटता की एक श्रृंखला ले. प्रत्येक वसूली, पूर्व - ब्लीच प्रतिदीप्ति के लिए सामान्यीकृत विश्लेषण, उचित गणितीय फार्म और एक गैर रेखीय कम से कम वर्गों फिटिंग एल्गोरिथ्म (देखें नीचे "डेटा विश्लेषण") का उपयोग. ब्लीच गहराई पैरामीटर के फिट मूल्य रिकार्ड.
- लेने और विश्लेषण ब्लीच सत्ता के मूल्यों में वृद्धि पर सांसद FRAP घटता के लगातार श्रृंखला जारी रखें.
- लॉग (बिजली) के एक समारोह के रूप में प्लॉट लॉग (ब्लीच गहराई पैरामीटर). दो में से एक ढलान से कोई विचलन उत्तेजना संतृप्ति इंगित करता है. एक ब्लीच शक्ति है कि एक मजबूत ब्लीच पैदावार चुनें, लेकिन संतृप्ति कारण नहीं है.
5. सांसद - FRAP घटता लेने जारी रखें.
- घटता लेने जारी रखें, इसके बाद के संस्करण के रूप में, सभी मापदंडों को ठीक से स्थापित किया जाएगा.
6. डेटा विश्लेषण.
- प्रतिदीप्ति डेटा से पूर्व ब्लीच और ब्लीच डेटा सेट और समय इस तरह के डेटा को समायोजित निकालें कि टी = प्रतिदीप्ति बाद ब्लीच तुरंत मान 0 मेल खाती है.
- औसत प्रतिदीप्ति पूर्व - ब्लीच करने के लिए सम्मान के साथ जिसके परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति वसूली सामान्यकरें.
- सामान्यीकृत उचित गणितीय मॉडल और MATLAB में lsqcurvefit समारोह के रूप में एक गैर रेखीय, कम से कम वर्गों फिटिंग एल्गोरिथ्म, का उपयोग वक्र फ़िट. यहाँ प्रस्तुत मॉडल प्रतिदीप्ति दोनों प्रसार और संवहनी प्रवाह से प्रभावित वसूली के लिए खातों:
τ विकास, जहां एफ ओ पूर्व ब्लीच औसत प्रतिदीप्ति है, β ब्लीच गहराई पैरामीटर है विशेषता वाचाल वसूली समय है, अनुसंधान अक्षीय के वर्ग का अनुपात w (z) रेडियल (डब्ल्यू आर) चौड़ाई के लिए है दो photon फोकल मात्रा, τ vx = w / r v x τ vy = w / r v, y τ VZ = z w / ध् z, और 2 ध् = v x 2 + y ध् 2 + v 2 Z है संवहनी प्रवाह की गति. इमेजिंग विमान तक ही सीमित प्रवाह के लिए, τ VZ → ∞ और 1 / τ vx + 1 / τ vy 1 / τ वी.आर. के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है है. संवहनी प्रवाह के अभाव में, अंश में दोनों exponentials 1 करने के लिए जाओ और अभिव्यक्ति केवल दो मानकों फिटिंग, और β τ विकास के लिए बहुत कम है,. प्रसार गुणांक डी = w आर डी 2 / 8τ के रूप में आसानी से गणना की है.
7. प्रतिनिधि परिणाम.
चित्रा 1 प्रतिनिधि ब्लीच और FITC-BSA के लिए वसूली वक्र. एक अच्छी वसूली की अवस्था पूर्ण वसूली पर डेटा के उत्तरार्द्ध के लिए सूचित किया जा रहा है प्रतिदीप्ति साथ एक मजबूत ब्लीच और चिकनी वसूली, दर्शाती है.
2 चित्रा FITC-BSA के लिए सामान्यीकृत वसूली वक्र (लाल) और जुड़े कम से कम वर्गों फिट (काला). यह फिट पैदावार 52.9 um2 एस / के प्रसार गुणांक, साहित्य के साथ संगत है.
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Discussion
बहु फोटॉन photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली की शक्ति इसके लिए 3 डी संकल्प के साथ मोटी नमूनों की जांच करने की क्षमता में निहित है. 1990 में इसके विकास के बाद से, सांसद FRAP सेल निकायों, पूर्व vivo मोटी ऊतक स्लाइस, और vivo में ऊतक और interstitium में प्रसार गुणांक (या अनुरूप परिवहन पैरामीटर) को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस अनुच्छेद में, हम सांसद FRAP, एक प्रयोग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से किरण पथ aligning के लिए उचित प्रक्रिया को चलाने के लिए आवश्यक उपकरणों को प्रस्तुत किया, प्रयोगात्मक मानकों की स्थापना, डेटा लेने और वसूली घटता का विश्लेषण.
एक उचित उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और उत्सर्जन फिल्टर के विकल्प दो photon पार वर्गों और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा द्वारा निर्देशित किया जाना चाहिए. यह जानकारी अक्सर विभिन्न रंगों के लिए तकनीकी डेटा के साथ शामिल है. इसके अलावा, लेजर बीम aligning में, यह महत्वपूर्ण है कि उद्देश्य के पीछे लेंस के समुचित overfilling हासिल किया है. यह अक्सर ऑप्टिकल प्रणाली के लिए एक बीम विस्तारक जोड़कर पूरा किया है. उचित overfilling दोनों axial और रेडियल दिशाओं में उप संकल्प तय फ्लोरोसेंट मोती स्कैनिंग और फिर साजिश रचने और Gaussians के लिए फिटिंग प्रतिदीप्ति प्रोफाइल साहित्य मूल्यों के साथ तुलना के लिए 1 / ई 2 चौड़ाई मिल द्वारा सत्यापित किया जा सकता है है .
यह भी उचित निगरानी और विरंजन शक्तियों का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है. पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया शक्ति प्रतिदीप्ति पूर्व और बाद ब्लीच कारण नहीं प्रशंसनीय विरंजन काफी कम होना चाहिए, लेकिन पर्याप्त उच्च करने के लिए एक अच्छा संकेत से शोर अनुपात के लिए अनुमति देते हैं. विरंजन शक्ति उत्तेजना संतृप्ति से बचना चाहिए. एक सांसद FRAP प्रयोग में प्रतिदीप्ति उत्तेजना दर है, जो नमूना पर बिजली की घटना के वर्ग के लिए आनुपातिक है एक ऊपरी सीमा है. इस सीमा उत्तेजना संतृप्ति शासन के निशान लगते हैं. प्रतिदीप्ति वसूली ब्लीच उत्तेजना संतृप्ति शासन में संचालन शक्तियों का उपयोग कर उत्पादन घटता ग़लती से कम प्रसार गुणांक निकलेगा.
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Acknowledgments
यह काम आशा है कि विद्वान पुरस्कार के रक्षा काल का एक विभाग (सं W81XWH-05-+०,३९६) और बायोमेडिकल साइंसेज एडवर्ड बी ब्राउन III के लिए पुरस्कार में एक बेंच विद्वान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ti:sapphire laser | Newport Corp. | Mai Tai | |
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | |
| Laser Scanning Microscope | Olympus Corporation | Fluoview | |
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 670 DCSX-2P | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | |
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | |
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | |
| FITC-BSA | Invitrogen | -- |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. rown, Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
