Summary
I denna artikel kommer vi att beskriva förfarandet för mätning diffusion koefficienter med hjälp av flera foton fluorescens återhämtning efter fotoblekning. Vi börjar med att rikta lasern längs den optiska väglängden till provet och fastställande av lämplig experimentella parametrar, då fortsätta att generera och slutligen montering fluorescens kurvor återhämtning.
Abstract
Multi-fluorescens återhämtning efter fotoblekning är en mikroskopi teknik som används för att mäta diffusionskoefficient (eller motsvarande transport parametrar) av makromolekyler, och kan tillämpas på både
Protocol
1. Rikta in optik.
Den viktigaste utrustningen för en MP-FRAP experiment är: en modlåsta laserkälla, Pockelscell (för balk modulering), pulsgivare, dikroiskt, objektiv, fluorescens utsläpp filter, gated fotomultiplikatorn rör och ett registreringssystem (photon räknare och flerkanals scaler).
2. Bestäm säker övervaka befogenheter.
- Dämpa laser för att en låg men rimlig, makt för att generera fluorescens i provet.
- Fokus i provet.
- Ställ en foton mot integrera över en tidsskala mycket längre än den förväntade fluorescens återhämtningen. Med fokus volymen hålls stilla i provet (på våra mikroskop mjukvaran Detta uppnås genom en punkt scan), spela in ett rimligt antal foton räkna data.
- Öka kraft och ta en serie foton räkna data. Upprepa tills den ökade fotonen räknar tycks minska kraftigt i förhållande till effektökningen.
- Plotta log (fotoner räknas) som en funktion av log (kraft). En avvikelse från en lutning på två indikerar blekning under skärmen. Välj som din monitorn en makt som är under denna avskuren, men som möjliggör en rimlig signal-brus-förhållande.
3. Bestäm ingångsparametrar till pulsgenerator och multikanal scaler.
- Bestäm back-of-the-kuvertet beräkningar av diffusion koefficient och återhämtning baserad på litteratur och / eller Stokes-Einsteins ekvation och diffusionsekvationen.
- Ställ in de nödvändiga parametervärden på pulsgeneratorn och scaler.
- På pulsgeneratorn, som före blekmedel och blekmedel gånger. En bra uppsättning tumregler är att före blekmedel bör vara 1-2 gånger större än den förväntade halv återhämtningstid, och blekmedel tid bör en tiondel den förväntade halv återhämtningstid.
- På scaler, ställ in bin bredden till ungefär en halv blekmedel varaktighet, och ange antal lådor per post så att produkten av valda bin bredd och lådor per post är större än eller ungefär lika med din förväntade full återhämtning plus pre -blekmedel och tider blekmedel.
- Återgå till pulsgeneratorn och ställ in frekvensen av pre-bleach/bleach/monitor sekvensen motsvarar ett värde bara är mindre än inversen av produkten av de gånger bin bredd antalet lådor per post. *
- Slutligen, ange antalet poster / skanning på scaler baseras på signalstyrkan på din valda bildskärmen ström.
* Det är mycket viktigt att tiden för en fullständig pre-bleach/bleach/monitor sekvens (1/frequency) inställt på pulsgeneratorn är större än den datainsamling tid (bin bredd x lådor / rekord) som på scaler. Om detta villkor inte uppfylls kan flera bleka utlöser visas i en enda post på scaler.
- Ställ in monitorn till en acceptabel nivå, bestämda tidigare. Ställ blekmedel makten till 200 mW eller så ovanför blekning cutoff bestäms under skärmen blekning testet. Dessa befogenheter är satta som olika spänningar över PC-kristall.
- Täta mikroskop, stänga av lampor, slå på PMT, börjar en punkt skanning på mikroskop mjukvaran, starta sedan pulsgenerator och scaler.
- Analysera den resulterande återhämtningen genom att plotta kurvan och märkning tre viktiga punkter: 1) före blekmedel fluorescens, 2) fluorescens direkt efter blekmedel, och 3) fluorescens i slutet av datamängden. Använd fluorescens värden före och direkt efter blekmedel för att bättre uppskatta halv-återhämtningstid.
- Med denna uppskattning av den halva återhämtningstid använder tumregler beskrivits tidigare för att bestämma nya värden för före blekmedel, blekmedel och bin löptider bredd. Använd också före blekmedel fluorescens och fluorescens i slutet av den uppsättning data för att bättre uppskatta den tid som krävs för att uppnå full återhämtning. Som en tumregel bör uppgifter samlas in för en tidsperiod som möjliggör fullständig återhämtning ska redovisas för den senare hälften av uppgifterna.
- Justera parametrarna för pulsgenerator och scaler, ta en ny kurva, och fortsätter du att anpassa parametrarna tills kurvan uppvisar ett starkt blekmedel och lugn återhämtning. Tänk på att de bleka varaktighet kan och bör vara mindre än tumregel, om möjligt. Den bleka makt kan också justeras om för grunt eller för djupt, är ett blekmedel uppnås.
4. Test för excitation mättnad.
- Hjälp av lämpliga övervaka och befogenheter blekmedel, bestämd tidigare, ta en serie av MP-FRAP kurvor. Analysera varje återhämtning, normaliserad till före blekmedel fluorescens med hjälp av lämpliga matematiska form och en icke-linjär minsta kvadrat passande algoritm (se "Data Analysis" nedan). Anteckna monterade värdet av blekmedel djup parameter.
- Fortsätt att ta och analysera löpande serier med MP-FRAP kurvor vid ökande värden på blekmedel makt.
- Plotta log (blekmedel djup parameter) som en funktion av log (kraft). Varje avvikelse från en lutning på två indikerar excitation mättnad. Välj ett blekmedel makt som ger ett starkt blekmedel, men inte orsakar mättnad.
5. Fortsätt att ta MP-FRAP kurvor.
- Fortsätt att ta kurvor, som ovan, kommer alla parametrar korrekt inställd.
6. Dataanalys.
- Ta bort före blekmedel och blekmedel data från fluorescens uppsättning uppgifter och ändra tiden data så att t = 0 motsvarar fluorescens värde direkt efter blekmedel.
- Normalisera den resulterande fluorescensen återhämtning i förhållande till den genomsnittliga före blekmedel fluorescens.
- Montera den normaliserade kurvan med lämplig matematisk modell och en icke-linjär, minsta kvadratmetoden montering algoritm, till exempel lsqcurvefit funktionen i MATLAB. Den modell som presenteras här står för fluorescens återkrav påverkas av både diffusion och konvektiv flöde:
där F o är före blekmedel genomsnittet fluorescens, är β blekmedel djupet parametern τ D karakteristiska diffusionsprovtagare återhämtningstid, R är den kvoten av kvadraten på den axiella (w z) till radial (w R) bredder av två-photon fokus volym, τ vx = w R / V x, τ VY = w R / V Y, τ VZ = w z / v z och v 2 = v x 2 + v y 2 + v z 2 är hastighet konvektiva flödet. För flödet begränsas till avbildning planet, τ VZ → ∞ och 1 / τ vx + 1 / τ VY kan ersättas med 1 / τ VR. I avsaknad av konvektiva flödet, både exponential i täljaren går till 1 och uttrycket är kraftigt reducerad, till endast två passande parametrar, β och τ D. Den diffusionskoefficient är lätt beräknas som D = w r 2 / 8τ D.
7. Representativa resultat.
Figur 1. Representant blekmedel och återhämtning kurva för FITC-BSA. En bra återhämtning kurva uppvisar ett starkt blekmedel och lugn återhämtning, med fluorescens vid fullständig återhämtning rapporteras för den senare hälften av uppgifterna.
Figur 2. Normaliserad återhämtning kurvan för FITC-BSA (röd) och tillhörande minsta kvadratmetoden (svart). Detta passar ger en spridning koefficienten 52,9 UM2 / s, i linje med litteraturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kraften i flera foton fluorescens återhämtning efter fotoblekning ligger i dess förmåga att söka tjocka prover med 3D-upplösning. Sedan dess utveckling under 1990-talet, har MP-FRAP använts för att bestämma diffusionskoefficient (eller liknande transporter parametrar) i cell organ, ex vivo tjocka skivor vävnad och in vivo vävnad och interstitium. I denna artikel presenterade vi den utrustning som krävs för att köra en MP-FRAP experiment, liksom korrekt förfarande för anpassning av strålens väg, inställning experimentella parametrar, med data samt att analysera återhämtning kurvor.
De val av lämplig excitationsvåglängden och filtrera utsläppen bör styras av de två-photon tvärsnitt och emissionsspektra. Denna information är ofta ingår i tekniska data för olika färgämnen. Även när det gäller anpassningen laserstrålen är det viktigt att rätt överfyllning av ryggen lins mål ska uppnås. Detta är ofta görs genom att en stråle Expander för att det optiska systemet. Korrekt överfyllning kan verifieras genom att skanna sub-upplösning fast fluorescerande pärlor i både axiell och radiell riktning och sedan rita och montering av fluorescens profiler för att Gaussians för att hitta den 1 / e 2 bredder för jämförelse med litteraturen värden.
Det är också viktigt att välja lämplig övervakning och blekning befogenheter. Kraften används för att övervaka fluorescens före och efter-blekmedel ska vara tillräckligt låga för att orsaka märkbar blekning, men tillräckligt hög för att möjliggöra en bra signal-brus-förhållande. Blekning makt måste undvika excitation mättnad. I en MP-FRAP experiment finns en övre gräns för fluorescens excitation ränta, som är proportionell mot kvadraten på strömmen incident på provet. Denna gräns markerar starten av excitation mättnad regimen. Fluorescens återhämtning kurvor produceras med blekmedel befogenheter verksamma i excitation mättnad regimen kommer att ge felaktigt låga diffusion koefficienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av ett försvarsdepartementet era av hopp Scholar Award (nr W81XWH-05-0396) och en Pew Scholar i biomedicin Award till Edward B. Brown III.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ti:sapphire laser | Newport Corp. | Mai Tai | |
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | |
| Laser Scanning Microscope | Olympus Corporation | Fluoview | |
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 670 DCSX-2P | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | |
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | |
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | |
| FITC-BSA | Invitrogen | -- |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. rown, Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
