Summary
Neste artigo iremos descrever o procedimento para medir coeficientes de difusão usando multi-fotão de recuperação de fluorescência após a fotodegradação. Vamos começar pelo alinhamento do laser ao longo do caminho óptico para a amostra e determinar os parâmetros adequados experimental, em seguida, continuar gerando e, finalmente, ajuste de curvas de recuperação de fluorescência.
Abstract
Multi-fluorescência de recuperação após fotodegradação é uma técnica de microscopia utilizadas para medir o coeficiente de difusão (ou parâmetros de transporte análogos) de macromoléculas, e pode ser aplicado tanto
Protocol
1. Alinhe as ópticas.
O equipamento fundamental para um experimento MP-FRAP incluem: um mode-locked fonte de laser, Cell Pockels (por feixe de modulação), gerador de pulso, dicróicas, lente objetiva, emissão de fluorescência de filtro, tubo fotomultiplicador fechado, e um sistema de gravação de dados (fóton counter e multicanal scaler).
2. Determine poderes monitorar segura.
- Atenuar o laser a um ponto baixo, mas razoável de energia, para a geração de fluorescência da amostra.
- Foco dentro da amostra.
- Definir um contador de fótons para integrar mais de uma escala de tempo muito mais do que a recuperação de fluorescência esperado. Com o volume focal realizada parado dentro da amostra (em nosso software microscópio isso é conseguido por um scan ponto), gravar um número razoável de dados de contagem de fótons.
- Aumentar o poder e tomar outra série de dados de contagem de fótons. Repita até que o aumento na contagem de fóton parece diminuir significativamente em relação ao aumento de potência.
- Log plot (contagem de fóton) como uma função de log (potência). Um desvio de uma pista de dois indica branqueamento durante o monitor. Escolher como seu poder monitorar um poder que está abaixo desse corte, mas que permite um sinal-ruído razoável.
3. Determinar parâmetros de entrada para o gerador de pulso e multicanal scaler.
- Determine back-of-the-envelope estimativas do coeficiente de difusão eo tempo de recuperação com base na literatura e / ou a equação de Stokes-Einstein ea equação de difusão.
- Definir os valores dos parâmetros necessários no gerador de pulsos eo scaler.
- No gerador de pulso, definir os tempos de pré-alvejante e água sanitária. Um bom conjunto de regras de ouro é que o pré-lixívia deve ser 1-2 vezes maior do que o tempo esperado de recuperação meia, eo tempo de lixívia deve ser um décimo do tempo de recuperação esperado meia.
- Sobre o scaler, definir a largura bin para aproximadamente metade da água sanitária, duração e definir o número de caixas por registro de tal forma que o produto de sua largura bin selecionados e caixas por registro for maior ou igual a cerca de sua recuperação que se espera cheio mais pre -lixívia e os tempos de lixívia.
- Retornar para o gerador de pulso e definir a freqüência da seqüência pre-bleach/bleach/monitor igual a um valor apenas menor do que o inverso do produto dos tempos bin largura do número de caixas por registro. *
- Por fim, defina o número de registros / scan no scaler com base na intensidade do sinal em sua alimentação do monitor escolhido.
* É muito importante que o tempo para uma seqüência pre-bleach/bleach/monitor completa (1/frequency) definido no gerador de pulso é maior do que o tempo de coleta de dados (bin largura x caixas / registro) set no scaler. Se este critério não for cumprido, triggers lixívia múltiplos podem aparecer dentro de um único registro no scaler.
- Definir a energia do monitor para um nível aceitável, determinado anteriormente. Definir o poder de lixívia para 200 mW ou mais acima do limite de branqueamento determinada durante o teste de monitor de branqueamento. Esses poderes são definidos como voltagens diferentes em todo o cristal PC.
- Seal ao microscópio, desligue as luzes, ligar a PMT, começam uma varredura ponto no software microscópio, em seguida, iniciar o gerador de pulso e scaler.
- Analisar a curva de recuperação resultante traçando a curva e marcando três pontos importantes: 1) o pré-fluorescência lixívia, 2) a fluorescência imediatamente pós-lixívia, e 3) de fluorescência no final do conjunto de dados. Use os valores de fluorescência pré e imediatamente pós-lixívia para melhor estimar o tempo de meia-recuperação.
- Com essa estimativa do tempo de recuperação de meia, use as regras de ouro descritos anteriormente para determinar novos valores para o pré-bleach bleach, e durações largura bin. Além disso, use a fluorescência pré-sanitária e de fluorescência no final do conjunto de dados para melhor estimar o tempo necessário para conseguir a recuperação completa. Como regra geral, os dados devem ser recolhidos para um período de tempo que permite a recuperação total serão comunicados para a segunda metade dos dados.
- Ajustar os parâmetros do gerador de pulso e scaler, dê uma nova curva, e continuar ajustando os parâmetros até a curva apresenta um alvejante forte e suave recuperação. Tenha em mente que a duração lixívia pode, e deve, ser reduzida abaixo da regra de ouro, se possível. O poder lixívia também pode ser ajustado se muito superficial ou muito profunda, um alvejante é alcançado.
4. Teste para a saturação de excitação.
- Usando monitor apropriado e poderes lixívia, determinado previamente, tomar uma série de MP-FRAP curvas. Analisar cada recuperação, normalizada para a fluorescência pré-lixívia, utilizando o formulário apropriado matemática e uma mínimos quadrados não-linear algoritmo de montagem (ver "Análise de Dados" abaixo). Registrar o valor do parâmetro equipado profundidade lixívia.
- Continue a tomar e analisar série sucessiva de MP-FRAP curvas de aumentar os valores de poder alvejante.
- Log plot (parâmetro de profundidade lixívia) como uma função de log (potência). Qualquer desvio de uma pista de dois indica a saturação de excitação. Escolha um poder alvejante que gera um lixívia forte, mas não causa saturação.
5. Continue a tomar MP-FRAP curvas.
- Continuar a tomar as curvas, como acima, vai todos os parâmetros devidamente definidos.
6. Análise de Dados.
- Remove os dados pré-alvejante e água sanitária a partir dos dados de fluorescência definir e ajustar os dados de tempo tal que t = 0 corresponde ao valor de fluorescência imediatamente pós-lixívia.
- Normalizar a recuperação de fluorescência resultante no que diz respeito à fluorescência pré-bleach média.
- O traçado da curva normalizada usando o modelo matemático apropriado e de um algoritmo não-linear, pelo menos, praças de montagem, como a função lsqcurvefit em MATLAB. O modelo apresentado aqui é responsável por recuperações de fluorescência influenciado por ambos difusão e fluxo de convecção:
onde F é a fluorescência o pré-bleach média, β é o parâmetro de profundidade de água sanitária, τ D é o tempo de recuperação característica difusivo, R é a razão entre o quadrado da axial (w z) e radial (w r) larguras das dois fótons de volume focal, τ vx = w r / v x, τ vy = w r / v y, τ vz = w z / v z e v 2 = v x 2 + v y 2 + v z 2 é o velocidade do fluxo convectivo. Para o fluxo confinado ao plano de imagem, τ vz → ∞ e 1 / τ vx + 1 / τ vy pode ser substituído com 1 / τ vr. Na ausência de fluxo de convecção, dois exponenciais no numerador vai para 1 ea expressão é muito reduzida, a apenas dois parâmetros de ajuste, β e τ D. O coeficiente de difusão é facilmente calculada como D = w r 2 / 8τ D.
7. Resultados representante.
Figura 1. Lixívia Representante ea curva de recuperação para FITC-BSA. A curva de boa recuperação exibe uma lixívia forte e suave recuperação, com a fluorescência em plena recuperação que está sendo relatado para a segunda metade dos dados.
Figura 2. Curva de recuperação Normalizado para FITC-BSA (vermelho) eo ajuste dos mínimos quadrados associados (preto). Este ajuste produz um coeficiente de difusão de 52,9 UM2 / s, de acordo com a literatura.
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Discussion
O poder da multi-fotão de recuperação de fluorescência após a fotodegradação reside na sua capacidade de sondar as amostras de espessura, com resolução em 3D. Desde seu desenvolvimento na década de 1990, MP-FRAP foi usado para determinar o coeficiente de difusão (ou parâmetros de transporte análoga) nos corpos celulares, ex vivo fatias grossas de tecido, e no tecido vivo e interstício. Neste artigo, apresentamos os equipamentos necessários para executar uma experiência MP-FRAP, bem como o procedimento adequado para alinhar o caminho do feixe, a definição de parâmetros experimentais, obtenção de dados, e analisar as curvas de recuperação.
As escolhas de um comprimento de onda de excitação adequado e filtro de emissão deve ser guiada pelos dois fótons de secções transversais e espectros de emissão. Esta informação é freqüentemente incluído com os dados técnicos para diversos corantes. Além disso, no alinhamento do feixe de laser, é importante que overfilling adequada da lente traseira do objetivo ser alcançado. Isso é muitas vezes realizado por adição de um expansor de feixe para o sistema óptico. Overfilling adequada pode ser verificada pela resolução de digitalização de sub-partículas fluorescentes fixos em ambas as direções axial e radial e depois traçar os perfis e montagem de fluorescência de gaussianas para encontrar a 1 / e 2 larguras para comparação com os valores da literatura.
Também é importante escolher um controlo adequado e poderes de branqueamento. O poder usado para monitorar a fluorescência pré e pós-lixívia deve ser baixa o suficiente para não causar apreciável de branqueamento, mas alto o suficiente para permitir uma relação sinal-ruído bom. O poder de branqueamento deve evitar a saturação de excitação. Em um experimento MP-FRAP existe um limite superior para a taxa de excitação de fluorescência, que é proporcional ao quadrado do incidente de energia sobre a amostra. Este limite marca o início do regime de saturação de excitação. Curvas de recuperação de fluorescência produzida usando poderes lixívia que operam no regime de saturação de excitação produzirá coeficientes de difusão erroneamente baixa.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por um Departamento de Defesa Era do Prêmio Acadêmico Hope (No. W81XWH-05-0396) e bolsista da Pew no Prêmio Ciências Biomédicas de Edward B. Brown III.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ti:sapphire laser | Newport Corp. | Mai Tai | |
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | |
| Laser Scanning Microscope | Olympus Corporation | Fluoview | |
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 670 DCSX-2P | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | |
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | |
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | |
| FITC-BSA | Invitrogen | -- |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. rown, Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
