Summary
In questo articolo andremo a descrivere il procedimento per determinare coefficienti di diffusione multi-fotone con il recupero di fluorescenza dopo photobleaching. Inizieremo allineando il laser lungo il percorso ottico al campione e determinare i parametri corretti sperimentale, poi continuare a generare ed infine montaggio curve recupero fluorescenza.
Abstract
Multi-fluorescenza recupero dopo photobleaching è una tecnica di microscopia utilizzato per misurare il coefficiente di diffusione (o parametri di trasporto analoghe) delle macromolecole, e può essere applicato sia
Protocol
1. Allineare l'ottica.
L'attrezzatura fondamentale per un MP-FRAP esperimento comprendono: un modo bloccato sorgente laser, Cell Pockels (per la modulazione del fascio), generatore di impulsi, dicroici, lenti dell'obiettivo, emissione di fluorescenza filtro, tubo fotomoltiplicatore recintato, e un sistema di registrazione dei dati (fotoni contatore e multicanale scaler).
2. Determinare i poteri del monitor di sicurezza.
- Attenuare il laser ad un basso, ma ragionevole, il potere di generare fluorescenza all'interno del campione.
- Messa a fuoco all'interno del campione.
- Impostare un contatore di fotoni per integrare su un arco temporale molto più lungo del previsto il recupero di fluorescenza. Con il volume focale tenuto fermo all'interno del campione (il nostro software di questo microscopio è ottenuto da una scansione punto), registrare un numero ragionevole di dati di conteggio di fotoni.
- Aumentare la potenza e prendere un'altra serie di dati di conteggio di fotoni. Ripetere fino a quando l'aumento del numero dei fotoni sembra diminuire in modo significativo rispetto alle aumentare la potenza.
- Plot log (conta fotone) in funzione di log (potenza). Una deviazione da un pendio di due indica sbiancamento durante il monitor. Scegli come alimentazione del monitor un potere che è inferiore a tale tagliata, ma che consente una ragionevole rapporto segnale rumore.
3. Determinare i parametri di ingresso al generatore di impulsi e multicanale scaler.
- Determinare back-of-the-envelope stime del coefficiente di diffusione e tempi di recupero basato sul / o letteratura e la equazione di Stokes-Einstein e l'equazione di diffusione.
- Impostare i valori dei parametri necessari per il generatore di impulsi e lo scaler.
- Sul generatore di impulsi, impostare i tempi di pre-lavaggio e di lavaggio. Un buon set di regole pratiche è che la pre-candeggina dovrebbe essere 1-2 volte più grande del previsto il recupero del primo tempo, e il tempo di candeggina dovrebbe essere un decimo il tempo di recupero previsto metà.
- Sul scaler, impostare la larghezza bin a circa la metà della durata di candeggina, e impostare il numero di cassonetti per registrare in modo tale che il prodotto della vostra larghezza bin selezionato e contenitori per ogni record è superiore o pari a circa il recupero completo più attesi pre -candeggina e tempi di candeggina.
- Ritorno al generatore di impulsi e impostare la frequenza della sequenza pre-bleach/bleach/monitor pari a un valore appena inferiore l'inverso del prodotto di volte la larghezza del bin il numero di cassonetti per record. *
- Infine, impostare il numero di record / scansione sul scaler in base all'intensità del segnale di alimentazione del monitor a vostra scelta.
* E 'molto importante che il tempo per una sequenza pre-bleach/bleach/monitor completa (1/frequenza) impostata sul generatore di impulsi è maggiore del tempo di raccolta dati (bin larghezza x cassonetti / registrazione) impostato sul scaler. Se questi criteri non è soddisfatto, fa scattare candeggina multiple possono apparire all'interno di un singolo record sul scaler.
- Impostare l'alimentazione del monitor ad un livello accettabile, determinato in precedenza. Impostare la potenza a 200 mW candeggina o giù di sopra del valore soglia sbiancamento determinata durante la prova di monitorare sbiancamento. Questi poteri sono entrambi impostati come differenti tensioni in tutto il cristallo PC.
- Sigillare il microscopio, spegnere le luci, accendere la PMT, iniziare una scansione punto sul software microscopio, quindi avviare il generatore di impulsi e scaler.
- Analizzare la curva di recupero conseguente tracciando la curva e marcatura tre punti importanti: 1) la pre-candeggina fluorescenza, 2) la fluorescenza immediatamente post-candeggina, e 3) la fluorescenza alla fine del set di dati. Utilizzare i valori di fluorescenza pre e immediatamente post-candeggina per valutare meglio il mezzo tempo di recupero.
- Con questa stima di metà tempo di recupero, utilizzare le regole pratiche descritte in precedenza per determinare i nuovi valori per la pre-candeggina, candeggina, e durate larghezza bin. Inoltre, utilizzare il pre-candeggina fluorescenza e fluorescenza, alla fine del set di dati per stimare meglio il tempo necessario per raggiungere il pieno recupero. Come regola generale, i dati devono essere raccolti per un periodo di tempo che consente il pieno recupero da segnalare per la seconda metà dei dati.
- Regolare i parametri del generatore di impulsi e scaler, prendere una nuova curva, e continuare il ritocco dei parametri fino a quando la curva mostra un forte candeggina e recupero liscia. Tenete a mente che la durata della candeggina, e dovrebbe, essere ridotto sotto la regola del pollice, se possibile. La potenza candeggina può anche essere regolato se troppo bassa o troppo profonda, una candeggina è raggiunto.
4. Test per la saturazione di eccitazione.
- Utilizzando monitor appropriato e poteri candeggina, determinato in precedenza, prendere una serie di MP-FRAP curve. Analizzare ogni recupero, normalizzato per il pre-candeggina fluorescenza, utilizzando l'apposito modulo matematico e un non-lineare dei minimi quadrati algoritmo di montaggio (si veda "Analisi dei dati" di seguito). Registrare il valore stimato del parametro profondità candeggina.
- Continuare a prendere e analizzare serie successiva di MP-FRAP curve ad aumentare i valori di potenza candeggina.
- Plot log (profondità parametro candeggina) in funzione di log (potenza). Qualsiasi deviazione da un pendio di due indica saturazione eccitazione. Scegli una potenza candeggina che produce un forte candeggina, ma non causa la saturazione.
5. Continuare ad assumere MP-FRAP curve.
- Continuare a prendere le curve, come sopra, saranno tutti i parametri impostati correttamente.
6. Analisi dei dati.
- Rimuovere i dati di pre-lavaggio e dai dati di fluorescenza impostare e regolare i dati al momento in cui t = 0 corrisponde al valore di fluorescenza immediatamente post-candeggina.
- Normalizzare il recupero di fluorescenza risultante rispetto alla media pre-candeggina fluorescenza.
- Montare la curva normalizzata utilizzando il modello appropriato matematico e un algoritmo non lineare, minimi quadrati, come ad esempio la funzione lsqcurvefit in MATLAB. Il modello presentato qui rappresenta recuperi fluorescenza influenzata sia la diffusione e il flusso convettivo:
dove F o è la pre-candeggina fluorescenza media, β è il parametro profondità candeggina, τ D è il tempo caratteristico di recupero diffusivo, R è il rapporto tra il quadrato della assiale (w z) a radiale (w r) larghezze della a due fotoni del volume focale, τ vx w = r / v x, τ vy = w r / v y, τ vz = w z / v z e v 2 = v x 2 + v y 2 + v z 2 è il velocità del flusso convettivo. Per il flusso confinato al piano di imaging, vz τ → ∞ e 1 / τ vx + 1 / τ vy può essere sostituito con 1 / τ vr. In assenza di flusso convettivo, esponenziali sia al numeratore va a 1 e l'espressione è notevolmente ridotto, a solo due parametri di montaggio, β e τ D. Il coefficiente di diffusione può essere facilmente calcolato come D = w r 2 / D 8τ.
7. Rappresentante dei risultati.
Figura 1. Candeggina Rappresentante e la curva di recupero per FITC-BSA. Una curva mostra un buon recupero candeggina forte e recupero graduale, con la fluorescenza in pieno recupero sono stati segnalati per la seconda metà dei dati.
Figura 2. Curva recupero normalizzato per FITC-BSA (rosso) e il relativo ai minimi quadrati (nero). Questa misura produce un coefficiente di diffusione del 52,9 UM2 / s, coerente con la letteratura.
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Discussion
La potenza del multi-fotone recupero di fluorescenza dopo photobleaching risiede nella sua capacità di sondare i campioni di spessore con risoluzione 3D. Dal momento che il suo sviluppo nel 1990, MP-FRAP è stato utilizzato per determinare il coefficiente di diffusione (o parametri di trasporto analoghe) in corpi cellulari, ex fette di tessuto vivo di spessore, e nel tessuto vivo e nell'interstizio. In questo articolo, abbiamo presentato l'attrezzatura necessaria per eseguire un MP-FRAP esperimento, così come la procedura corretta per allineare il percorso del fascio, l'impostazione dei parametri sperimentali, prendendo i dati e l'analisi curves recupero.
Le scelte di una lunghezza d'onda di eccitazione e appropriato filtro per le emissioni dovrebbero essere guidati dai due fotoni sezioni e spettri di emissione. Questa informazione è spesso inclusa con i dati tecnici per le tinture varie. Inoltre, in allineamento del fascio laser, è importante che eccessivo riempimento corretto della lente posteriore dell'obiettivo da raggiungere. Questo è spesso realizzato con l'aggiunta di un espansore fascio al sistema ottico. Eccessivo riempimento corretto può essere verificata attraverso la scansione sub-risoluzione perline fluorescenti fisso in entrambe le direzioni assiale e radiale e poi di tracciamento e di raccordo dei profili di fluorescenza di gaussiane per trovare la 1 / e 2 larghezze per il confronto con i valori della letteratura.
E 'anche importante scegliere un adeguato monitoraggio e poteri sbiancamento. La potenza utilizzato per monitorare la fluorescenza di pre-e post-candeggina dovrebbe essere abbastanza basso da non causare apprezzabili sbiancamento, ma abbastanza alta da consentire un buon segnale-rumore. Il potere sbiancante deve evitare la saturazione eccitazione. In un MP-FRAP esperimento esiste un limite superiore della frequenza di eccitazione di fluorescenza, che è proporzionale al quadrato della potenza incidente sul campione. Questo limite segna l'inizio del regime di saturazione eccitazione. Curve di recupero fluorescenza prodotta con poteri candeggina che operano in regime di saturazione eccitazione produrrà coefficienti di diffusione erroneamente bassi.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da un Dipartimento di Era Difesa del Premio Speranza Scholar (n. W81XWH-05-0396) e un Scholar Pew al Premio Scienze Biomediche a Edward B. Brown III.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ti:sapphire laser | Newport Corp. | Mai Tai | |
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | |
| Laser Scanning Microscope | Olympus Corporation | Fluoview | |
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 670 DCSX-2P | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | |
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | |
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | |
| FITC-BSA | Invitrogen | -- |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. rown, Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
