Summary
एक microfluidic आइलेट perifusion डिवाइस कई islets और कैल्शियम बाढ़ और mitochondrial संभावित परिवर्तनों के साथ - साथ प्रतिदीप्ति इमेजिंग के गतिशील इंसुलिन स्राव के मूल्यांकन के लिए विकसित किया गया था.
Abstract
एक microfluidic आइलेट perifusion डिवाइस कई islets और कैल्शियम बाढ़ और mitochondrial संभावित परिवर्तनों के साथ - साथ प्रतिदीप्ति इमेजिंग के गतिशील इंसुलिन स्राव के मूल्यांकन के लिए विकसित किया गया था. डिवाइस तीन परतों के होते हैं: पहली परत microscale (500 सुक्ष्ममापी व्यास और 150 सुक्ष्ममापी गहराई) कुओं कि islets स्थिर जबकि प्रवाह और islets के उजागर सतह क्षेत्र को अधिकतम करने के लिए उजागर करने में मदद की एक सरणी शामिल हैं, दूसरी परत एक परिपत्र शामिल perifusion कक्ष (3 गहरी मिमी, 7 मिमी व्यास), और तीसरी परत एक इनलेट चैनल मिश्रण होता है कि प्रशंसकों के बाहर पहले perifusion चेंबर में अनुकूलन के लिए इंजेक्शन (चौड़ाई में 2 मिमी, लंबाई में 19 मिमी, और ऊंचाई में 500 सुक्ष्ममापी) मिश्रण दक्षता से पहले perifusion कक्ष में प्रवेश करने के लिए. एक रेखीय, घंटी आकार सहित विभिन्न ग्लूकोज gradients, और वर्ग आकार के निर्माण microfluidic perifusion नेटवर्क में भी बनाया जा सकता है और प्रदर्शन.
Protocol
3 परत perifusion microfluidic डिवाइस के ए Microfabrication
नीचे खैर मास्टर प्रोटोकॉल (150 सुक्ष्ममापी गहरे कुओं)
- एक रेजर ब्लेड का उपयोग अगर जरूरत वफ़र साफ़. एसीटोन, मेथनॉल, और आईपीए के साथ साफ. 50 वाट में 30 एस के लिए प्लाज्मा उपचार प्रदर्शन
- स्पिन SU8-100 @ 2000 rpm के. [चरण 1: 500 rpm, 10 एस, 100 rpm / एस, चरण 2: 2000 rpm, 30 एस, 300 rpm / s].
[नोट: SU8 कताई के बाद चिमटी के साथ नहीं वफ़र पकड़] - शीतल सेंकना 65 पर वफ़र ° ° सी 20 मिनट के लिए और 95 पर 50 मिनट के लिए सी.
- वफ़र एक वांछित मुखौटा के माध्यम से पराबैंगनी प्रकाश के संपर्क में है. 150 सुक्ष्ममापी ऊंचाई के लिए खुराक MJ 650 / 2 सेमी है .
- डाक जोखिम 65 में वफ़र सेंकना ° 1 मिनट के लिए और 95 डिग्री सेल्सियस सी 12 मिनट के लिए.
- 15 मिनट के लिए डेवलपर SU8 में वफ़र विकास.
Microchannel मास्टर प्रोटोकॉल (500 सुक्ष्ममापी गहरे कुओं)
- एक रेजर ब्लेड का उपयोग अगर जरूरत वफ़र साफ़. एसीटोन, मेथनॉल, और आईपीए के साथ साफ. 50 वाट में 30 एस के लिए प्लाज्मा उपचार प्रदर्शन
- SU8-2150 @ 1000 rpm स्पिन. [चरण 1: 500 rpm, 10 एस, 100 rpm / एस, चरण 2: 1000 rpm, 30 एस, 300 rpm / s].
- शीतल 65 में वफ़र सेंकना डिग्री सेल्सियस 15 मिनट के लिए और 95 पर ° सी 2 घंटे और 30 मिनट के लिए.
- वफ़र एक वांछित मुखौटा के माध्यम से पराबैंगनी प्रकाश के संपर्क में है. 650 सुक्ष्ममापी ऊंचाई के लिए एक्सपोजर खुराक MJ 685 / 2 सेमी है.
- डाक जोखिम 65 में वफ़र सेंकना ° 5 मिनट के लिए और 95 डिग्री सेल्सियस सी 35 मिनट के लिए.
- 20-30 मिनट के लिए SU8 डेवलपर में वफ़र का विकास करना.
PDMS समाधान तैयारी
- Polydimethylsiloxane समाधान (PDMS) अच्छी तरह से एक मानक Sylgard 184 किट के इलाज के एजेंट के भाग 1 के साथ सिलिकॉन elastomer के 10 भागों मिश्रण से तैयार है.
- बुलबुले मिश्रण की प्रक्रिया के दौरान PDMS समाधान में उत्पन्न निर्वात desiccator का उपयोग कर हटा रहे हैं.
- बुलबुला मुक्त PDMS समाधान धीरे SU8 स्वामी और तीसरी परत के लिए एक खाली पेट्री डिश पर तिरस्कृत है.
- गर्म थाली का तापमान 75 के लिए सेट कर दिया जाता है डिग्री सेल्सियस और PDMS इस तापमान पर 2 बजे के लिए ठीक है
- Inlets, दुकानों, और विनिमय कुओं उपयुक्त आकार छेद छेदने का शस्र का उपयोग कर बाहर छिद्रित हैं.
- परतें एक साथ एक गिलास स्लाइड एक हाथ में प्लाज्मा डिवाइस का उपयोग कर (आकार 0.1 मिमी) पर बंधुआ हैं.
बी प्रायोगिक सेटअप
- फ्लो माइक्रो डिवाइस के माध्यम से 70% इथेनॉल बाँझ. फ्लो डि इथेनॉल धोने के लिए पानी. Microchannel दीवारों को इंसुलिन की गैर विशिष्ट सोखना को रोकने के लिए डिवाइस के माध्यम से 0.5% BSA के 50 मिलीलीटर Perfuse.
- ग्लूकोज रैंप ढाल और अन्य संबंधित LabVIEW सॉफ्टवेयर है कि सिरिंज पंप को यकीन है कि gradients स्थिर हैं परीक्षण कर रहे हैं के साथ संचार के द्वारा उत्पन्न gradients.
- 25-30 चूहों islets 5 सुक्ष्ममापी (कैल्शियम संकेतक, आण्विक जांच, सीए) और 37 ° सी में 30 मिनट के लिए 2.5 सुक्ष्ममापी 123 rhodamine Fura-2/AM (Rh123, mitochondrial क्षमता सूचक, सिग्मा, एमओ) के साथ incubated रहे थे क्रेब्स घंटी (KRB) बफर 2 मिमी ग्लूकोज युक्त
- चूहों islets ध्यान इनलेट पोर्ट के माध्यम से कर रहे हैं microfluidic perifusion डिवाइस में pipetted.
- microfluidic नेटवर्क तो सिरिंज पंप Tygon टयूबिंग और एक वाई संबंधक और अंश कलेक्टर करने के लिए आउटलेट का उपयोग करने के लिए प्रवेश को जोड़ने के द्वारा सेटअप है. डिवाइस खुर्दबीन पर एक हीटिंग मंच (37 डिग्री सेल्सियस) पर बैठता है और इनलेट टयूबिंग एक hotplate पर गरम किया जाता है 37 में कक्ष और समाधान के तापमान रखने डिग्री सेल्सियस
- तत्काल सेटअप के बाद, चूहों islets KRB 10 मिनट और फिर 25 मिनट के लिए एक ग्लूकोज रैंप (25mm 2mm) के लिए 2 मिमी ग्लूकोज युक्त के साथ perifused हैं.
- समय चूक छवियाँ एकत्र कर रहे हैं और विश्लेषण SimplePCI सॉफ्टवेयर के द्वारा हर 15 एस. perifusate भी हर मिनट एक अंश कलेक्टर का उपयोग करने के लिए इंसुलिन स्राव एलिसा किट का उपयोग कर का विश्लेषण एकत्र की है.
प्रतिनिधि परिणाम
माउस islets 2-25 मिमी ग्लूकोज की एक रैखिक ढाल के साथ perifused थे. जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, कैल्शियम बाढ़ और इंसुलिन स्राव perifusion के बारे में 13 मिनट, 6 मिमी ग्लूकोज इसी के बाद ट्रिगर कर रहे हैं. Mitochondrial क्षमता में परिवर्तन के रूप में की उम्मीद पहले देखा जाता है, के बारे में 11 मिनट पर. यह डेटा इस microfluidic नेटवर्क का उपयोग कर आइलेट फिजियोलॉजी विशेषताएँ का लाभ दर्शाता है.
चित्रा 1 शारीरिक प्रतिक्रियाओं सेल उत्तेजना आइलेट.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
पारंपरिक आइलेट perifusion सिस्टम (macroscale और microscale) सेटअप और डिजाइन, उच्च तकनीकी आवश्यकताओं, और प्रणाली में उपयोगकर्ता निर्धारित रासायनिक gradients बनाने की कठिनाई के परिसर सहित कुछ सीमाएँ है. microfluidic perifusion यहाँ वर्णित प्रणाली के डिजाइन और निर्माण के सरल ज्यामिति के साथ इन सीमाओं पर काबू. अधिक महत्वपूर्ण, इस प्रणाली प्रतिदीप्ति इमेजिंग दृष्टिकोण है कि आइलेट फिजियोलॉजी अध्ययन के लिए एक अनूठा उपकरण के रूप में प्रदान के साथ एकीकृत किया जा सकता है. उच्च संकेत शोर अनुपात और इन संकेतों के प्रतिदीप्ति स्थानिक लौकिक संकल्प के साथ प्रदर्शन प्रणाली. वर्तमान प्रोटोटाइप डिवाइस भी एक चिप में कई setups perifusion पकड़ और व्यापक आवेदन उद्देश्यों के लिए microenvironments की विभिन्न प्रकार प्रदान कर सकते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
इस काम Adeola Adewola, NIH / (U42RR023245) NCRR जोस Oberholzer, और शिकागो मधुमेह परियोजना AAUW अंतरराष्ट्रीय फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60ml Syringes | BD Biosciences | ||
| Fura-2 fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine123 Fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30" Silicone tubings | Cole-Parmer | 1/16 x 1/8in | |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16” & 4mm | |
| Syringe connectors | Cole-Parmer | female luer plug 1/16” | |
| Straight connectors | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Elbow connector | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Havard syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Perifusion device | |||
| Hot plate | PMC | ||
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Fraction collector | Gibson | ||
| Pippettor | Fisher Scientific | ||
| Inverted epiflorescence microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Charge-coupled device | QImaging | Retiga-SRV, Fast 1394 |
References
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
